液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器,、泵,、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器,、記錄儀等幾部分組成,。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相,，被流動相載入色譜柱（固定相） 內(nèi),，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運(yùn)動時,，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程,，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,，通過檢測器時,，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來,。

 

　　液相色譜儀按其分離機(jī)理,，可分為四種類型。

 

　　吸附色譜法的固定相為吸附劑,，色譜的分離過程是在吸附劑表面進(jìn)行的,，不進(jìn)入固定相的內(nèi)部。與氣相色譜不同,，流動相（即溶劑）分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用,。在吸附劑表面，樣品分子與流動相分子進(jìn)行吸附競爭,，因此流動相的選擇對分離效果有很大的影響,，進(jìn)口液相色譜儀一般可采用梯度淋洗法來提高色譜分離效率。

 

　　在聚合物的分析中,，吸附色譜一般用來分離添加劑,，如偶氮染料、抗氧化劑,、表面活性劑等,，也可用于石油烴類的組成分析。

 

　　分配色譜法

 

　　這種色譜的流動相和固定相都是液體,，樣品分子在兩個液相之間很快達(dá)到平衡分配,，利用各組分在兩相中分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，類似于萃取過程,。

 

　　一般常用的固定液有（ODPN）,、聚乙二醇（PEG400～4000）、*撐乙二醇（TMG）和角鯊?fù)椋⊿Q）,。采用與氣相色譜（GC）同樣的方法,，將固定液涂漬在多孔的載體表面,，但在使用中固定液易流失。目前,，應(yīng)用較多的是鍵合固定相,。在這種固體相中，固定液不是涂在載體表面,，而是通過化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機(jī)基團(tuán),。

 

　　例如，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基（-OH）之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面,。這種固定液的優(yōu)點(diǎn)是不易被流動相剝蝕,。在分配色譜法中，流動相可為純?nèi)軇?，也可以采用混合溶劑進(jìn)行梯度淋洗,，其極性應(yīng)與固定液差別大一些，以避免兩者之間相溶,。

 

　　與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，液相色譜儀所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度,，使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展,，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離,。

 

　　液相色譜儀有“四高一廣”的特點(diǎn)：

 

　　①高壓：流動相為液體,，流經(jīng)色譜柱時,，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱,，必須對載液加高壓,。

 

　　②高速：分析速度快,、載液流速快,，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘,，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成,，一般小于1小時。

 

　?、郏悍蛛x效能高,。可選擇固定相和流動相以達(dá)到分離效果,，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍,。

 

　?、芨哽`敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級,。

 

　?、輵?yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn),、大分子,、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析,，顯示出優(yōu)勢,。

 

　　⑥柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

 

　?、邩悠妨可?、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備,。

 

　　此外液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用,、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn),，但也有缺點(diǎn),，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充,。液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”,。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器,、柱接頭,、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化,，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬,，柱效率降低。液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜,。

 

　　液相色譜儀成為解決生化分析問題zui有前途的方法,。由于液相色譜儀具有高分辨率、高靈敏度,、速度快,、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn),，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué),、食品分析、醫(yī)藥研究,、環(huán)境分析,、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域,。液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。

 

　　液相色譜儀質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)受到普遍重視,，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等,； 液相色譜- 紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類,，海水中的不揮發(fā)烴類,，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。

 

　　造成這種情況的原因一般是色譜柱被污染,，或柱頭填料塌陷導(dǎo)致的,。

 

　　進(jìn)口液相色譜儀對于*種情況，先用純水反向沖洗柱子,，然后換成甲醇沖洗,，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗,，然后用純水沖洗,，zui后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,，則考慮第二種情況,。

 

　　對于第二種情況，擰開柱頭,，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料）,，裝入新填料,，滴一滴甲醇，填料下陷,，再填,，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平,，滴甲醇,，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平,。柱頭用甲醇沖洗干凈,，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭,，用純甲醇沖洗30分鐘以上,。

 

　　對液相色譜儀的要求

 

　　1.流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0.45μm或更細(xì)的膜過濾）,。

 

　　2.流動相過濾后要用超聲波脫氣,，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用,。

 

　　3.不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液,。

 

　　4.使用緩沖溶液時,，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗40分鐘以上,，以充分洗去離子,。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上,。

 

　　5.長時間不用儀器,，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子,，而應(yīng)該用有機(jī)相（如,，甲醇等），因?yàn)?，純水易長霉,。

 

　　6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。

 

　　7.C18柱不能進(jìn)蛋白樣品,，血樣,、生物樣品。

 

　　8.堵塞導(dǎo)致壓力太大,，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗,，清洗方法：

 

　　①以異丙醇作溶劑沖洗,；

 

　?、诜旁诋惐贾虚g用超聲波清洗；

 

　?、塾?0％稀硝酸清洗,；

 

　　9.氣泡會致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差,，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡,。

 

　　10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動相的清洗,。

 

　　11.進(jìn)口液相色譜儀要注意柱子的pH值范圍,，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品,。

 

　　12.更換流動相時應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗,，然后插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下,。