目錄:上海烜雅生物科技有限公司>>分子生物學試劑>>試劑盒>> DNA 5’末端磷酸化試劑盒
| 供貨周期 | 現貨 | 規(guī)格 | 20次 |
|---|---|---|---|
| 貨號 | XY-D-1884 | 應用領域 | 化工,生物產業(yè) |
| 主要用途 | 科研 | 英文名稱 | DNA 5’ End Phosphorylation Kit |
| 保存條件 | -20℃ | 有效期 | 1年 |
產品簡介：
本產品為 DNA 5’末端標記系統，利用 T4 Polynucleotide Kinase（T4 多聚核苷酸激酶）和［γ-32P］ATP 對粘性末端或平末端的 DNA 或 RNA 的 5’末端進行高效標記反應。
產品特點：
1.使用本試劑盒之前，不需要對 5’末端的磷酸基團進行去磷酸化處理，因為使用的kinase 能使 5’末端的磷酸與[γ-32P]ATP 的γ-磷酸進行交換,。
2.合成的單鏈或雙寡核苷酸的 5’末端游離的 OH 基團都能通過 Kinase 反應被標記
（或者只是簡單的磷酸化）。
3.提供的兩種反應液使交換反應和磷酸化反應都能高效進行,， 均能得到大于106cpm/pmol（5’﹣end）的比活性,。
4.快速，最快 25 分鐘即可完成標記反應,。
5.本產品足夠 20 次 20?L 體系的填入法標記實驗,。
6.DNA 5’末端磷酸化試劑盒只能用于科研。
產品參數：
成份規(guī)格包裝
T4 多聚核苷酸激酶
（10 U/μL）20 ?L0.5mL 綠蓋管
5×交換反應緩沖液100 ?L0.5mL 紅蓋管
10×磷酸緩沖液50 ?L0.5mL 黃蓋管
Control DNA20 ?L0.5mL 藍蓋管
使用手冊1 份無
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存,，有效期一年,。
自備試劑
DNA 片段、［γ-32P］ATP 或其它的標記,、未標記的 ATPs,、牛小腸堿性磷酸。
使用方法：
一,、交換反應
1.實驗前需自備的試劑：7M 醋酸銨,、100%乙醇、70%乙醇等
2.在微量離心管中制備下列反應液：
注：5 pmoles 的 5’末端約等于 0.17μg 的長 100bp 的雙鏈 DNA,。
3.37℃反應 30 分鐘,。
4.70℃加熱 5-10 分鐘使酶失活。
5.加入 10μL 的 7M CH3COONH4（pH 4.5）,。如使用 CH3COONa 做乙醇沉淀時使其終濃度達 300mM。
6. 加入 87.5μL（2.5 倍）的冷無水乙醇,，-20℃放置 30-60 分鐘,。
7.離心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀,，真空干燥,。
8.用適當 Buffer 溶解沉淀。
注：通過第 5-8 步操作幾乎可以除去大部分未反應的[γ-32P] ATP,，如要完-全其除去時,，乙醇沉淀后用凝膠過濾等方法精制即可。如需用苯-酚抽提除去蛋白質時,， 請在第 8 步之后進行,。
二、磷酸化反應標記
A.去磷酸化反應
9.實驗前需自備的試劑：TE 飽和酚/氯仿,、3M NaCl,、100%乙醇、70%乙醇,、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）等,。
10.在微量離心管中制備下列反應液：
成分用量
自備的 DNA 片段133 μL(≤10 μg)
1 M Tris-HCl，pH 8.015 μL
牛小腸堿性磷酸酶
（CIAP,，10~20 U/μL）2 ?L
滅菌的超純水補水至 150 ?L
總體積150 μL
11.50℃反應 30 分鐘,。
12.加入 150 μL 的 TE 飽和酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），充分混勻,。
13.離心,，取上層（水層）移到另一個微量離心管中。
14.重復操作 12-13,。15.
16. 加入 7.5μL 的 3M NaCl（最終濃度 150mM）,。
17. 加入 375μL（2.5 倍量）的冷無水乙醇,，-20℃放置 30-60 分鐘。
18.離心回收沉淀,，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后,，沉淀真空干燥。
19.使用 20μL 的 TE Buffer 溶解沉淀,。 B.磷酸化反應（前反應）
20.在微量離心管中制備下列反應液：
21.37℃反應 30 分鐘,。
22.下面的操作與交換反應的第 4-8 步操作相同。
三,、合成 DNA 寡核苷酸的標記
23.在微量離心管中制備下列反應液：
24.37℃反應 30 分鐘,。
25.下面的操作與交換反應的第 4-8 步操作相同。
26.當摻入水平很低的時候,，需要使用本步驟,，即通過體積排阻色譜或過濾試劑盒除去未反應的標記。Sephadex G﹣50 層析柱（需另購）對于去除未摻入的 dNTPs 效果很好,，它還能大幅減少小于 20 個堿基的DNA 寡核苷酸和小于 20bp 的雙鏈DNA 的量,。使用之前需要在70℃加熱5-10 分鐘以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 層析柱可以用來純化長度不小于 10 個堿基的寡核苷酸,。
選擇我們的DNA 5’末端磷酸化試劑盒,，就是選擇精準、高效,、可靠的檢測方案,，為您的科研實驗保駕護航！
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