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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

易錯(cuò)PCR（Error-Prone PCR）是利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′ 校對(duì)功能

的特性,，在一定條件下（如不同的dNTP 濃度,、Mg2+濃度和 MnCl2 存在）能夠以較高的機(jī)率隨機(jī)引入突變,。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法,，則可從構(gòu)建的突變庫中篩選出所需突變體。很多時(shí)候,，用戶需要通過易錯(cuò)PCR 得到不同突變數(shù)的DNA 片段,。為滿足此需求， 本公司開發(fā)了可調(diào)易錯(cuò)PCR 試劑盒,。在實(shí)用過程中,，發(fā)現(xiàn)易錯(cuò)PCR 循環(huán)數(shù)很難優(yōu)化， PCR 循環(huán)數(shù)過多或過少都得不到清晰的 DNA 條帶用于后續(xù)回收和克隆。本公司繼續(xù)改進(jìn)并推出染料法實(shí)時(shí)可調(diào)易錯(cuò)PCR 試劑盒,。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用,，十分簡(jiǎn)單方便。

2.在熒光信號(hào)進(jìn)入平臺(tái)期即可終止循環(huán),，此時(shí)電泳就可以得到清晰的突變 DNA 條帶,， 不需要盲目摸索，節(jié)約大量的時(shí)間,。

3.實(shí)驗(yàn)人員在一定范圍內(nèi)可以控制突變率,，一輪 PCR 的突變率范圍在 2-8 個(gè)突變

/1000 bp，更高的突變率可以通過多輪PCR 達(dá)到,。

4.可用于連續(xù)易錯(cuò) PCR,，只需把上一次易錯(cuò) PCR 的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò) PCR 的模板即可,，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變,。

5.可以擴(kuò)增的 DNA 片段更長(zhǎng)，以突變率設(shè)置為 0.1%以下的條件進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),，靶分子長(zhǎng)度可達(dá) 2 Kb,，對(duì)于 2 Kb 以上的產(chǎn)物，建議分段擴(kuò)增,。

6.本試劑盒足夠 100 次 30 ?L 體系的染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò)PCR,。

7.染料法實(shí)時(shí)可調(diào)易錯(cuò) PCR 試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

5×染料法實(shí)時(shí)可調(diào)易錯(cuò)PCR Mix

（含dNTP）600 ?L1.5 mL 黃蓋管

可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用

Taq DNA 聚合酶（5 U/?L）50 ?L0.5 mL 紅蓋管

可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用 MnCl300 ?L0.5 mL 紫蓋管

可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用dGTP300 ?L0.5 mL 藍(lán)蓋管

10×可調(diào)易錯(cuò)PCR 追加dNTP300 ?L0.5 mL 本色管

使用手冊(cè)1 份1 份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸,，-20℃保存, 有效期為一年,。

自備試劑

引物、DNA 模板,、常規(guī) PCR 試劑盒,。

使用方法：

1.將引物稀釋到 10 μM。引物也是決定易錯(cuò) PCR 成敗的關(guān)鍵因素,，設(shè)計(jì)引物時(shí)要 

保證其 Tm 在 70℃,，長(zhǎng)度在 25-30 nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間,，3′  端

GC 含量低,，并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2.用自備易錯(cuò)PCR 引物和自備的常規(guī)PCR 試劑擴(kuò)增制備易錯(cuò)DNA 模板（常規(guī) PCR 產(chǎn)物）,，膠回收并準(zhǔn)確確定濃度,。注意：易錯(cuò) PCR 的模板一定要用膠回收的常規(guī) PCR 產(chǎn)物，因?yàn)槟z回收會(huì)可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除,，否則這些片段由于也是用易錯(cuò) PCR 引物擴(kuò)增所得,，在易錯(cuò) PCR 擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制,，降低靶分子的擴(kuò)增效率,。

3.將回收的 DNA 片段（模板）稀釋到 100 ng/?L,、10 ng/?L 和 1 ng/?L 三個(gè)濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素,，模板 DNA 為非突變 DNA,， 擴(kuò)增產(chǎn)生的 DNA 為突變DNA，易錯(cuò) PCR 體系最終 DNA 產(chǎn)量是基本固定的,，因此模板 DNA 使用量越大,，則突變 DNA 在終產(chǎn)物中的相對(duì)比例就越低，突變率就越低,。故建議同時(shí)測(cè)試三個(gè)模板用量,。如果都成功，則優(yōu)先選用模板濃度低的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析,。

4.根據(jù)每 1000 bp 的預(yù)期突變數(shù)按下表確定 30 ?L 易錯(cuò) PCR 體系中 MnCl2 和 dGTP 的用量（這是在模板 DNA 不超過 1 ng 的前提下的數(shù)據(jù)）,。表中的 Mn 表示可調(diào)易錯(cuò) PCR 專用的 MnCl2, dG 表示可調(diào)易錯(cuò) PCR 專用的 dGTP：

5.設(shè)置 30 ?L 體系的可調(diào)易錯(cuò)PCR：第一次建議設(shè)置 3 個(gè)模板濃度。在 3 個(gè)干凈的

PCR 管中,，分別加入下列成分,。最后加可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用 MnCl2：

成分模板用量 1模板用量 2模板用量 3

5×染料法實(shí)時(shí)可調(diào)易錯(cuò)PCR

Mix6 ?L6 ?L6 ?L

可調(diào)易錯(cuò)PCR

專用dGTP根據(jù)上步

用量表表選擇根據(jù)上步

用量表選擇根據(jù)上步

用量表選擇

自備 DNA 模板1 ?L

（100

ng/?L）1 ?L

（10 ng/?L）1 ?L

（1 ng/?L）

自備PCR 引物(10 ?M each)1 ?L each1 ?L each1 ?L each

可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用

Taq DNA 聚合酶0.5 ?L0.5 ?L0.5 ?L

可調(diào)易錯(cuò)PCR

專用 MnCl2根據(jù)上步

用量表表選擇根據(jù)上步

用量表表選擇根據(jù)上步

用量表表選擇

自備超純水補(bǔ)水到 30 ?L補(bǔ)水到 30 ?L補(bǔ)水到 30 ?L

注意：5×染料法實(shí)時(shí)可調(diào)易錯(cuò)PCR Mix 冷凍后有沉淀，使用前可 65℃水浴加熱溶解至透明無色使用,。

6.按已經(jīng)優(yōu)化的常規(guī)PCR 條件進(jìn)行染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò)PCR：

注：由于易錯(cuò) PCR 含高濃度的 Mg2+,，因此容易形成引物二聚體，因此需要使用60℃這種較高的復(fù)性溫度,，以避免小片段擴(kuò)增產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)性抑制 PCR,。易錯(cuò) PCR 一般不需要熱啟動(dòng)，也不需要在易錯(cuò) PCR 結(jié)束后做延伸處理,。易錯(cuò) PCR 循環(huán)次數(shù)越多,，突變 DNA(擴(kuò)增產(chǎn)物)與非突變 DNA(原始模板)的比例就越高。此外在突變率和模板長(zhǎng)度恒定的情況下,，擴(kuò)增次數(shù)越多,，發(fā)生突變的絕對(duì)數(shù)就越高，在同一模板上發(fā)生的突變位點(diǎn)數(shù)就越多,。但循環(huán)數(shù)過多或過少都不容易在電泳時(shí)形成清晰的 DNA 條帶,，沒有條帶就沒法回收克隆。所以需要在熒光信號(hào)進(jìn)入平臺(tái)期后立即停止PCR,。

7.染料法實(shí)時(shí)易錯(cuò) PCR 結(jié)束后,，取 3 ?L 電泳檢查。

8.如果有預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物,，則用剩余的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收,，再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。

9.如需要提高突變率，可以選擇上輪易錯(cuò) PCR 產(chǎn)物為模板,，再進(jìn)行下一輪易錯(cuò) PCR,。

10.如果第一輪易錯(cuò) PCR 沒有得到預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物或者擴(kuò)增 60 次也沒有熒光信號(hào)，可以按下列操作進(jìn)行一輪追加 PCR,。

11.在 PCR 管中,，加入 3 ?L 10×可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用追加dNTP 到 27 ?L 電泳剩下的第一輪易錯(cuò)PCR 體系中（用了 3 ?L 去電泳），按下表進(jìn)行追加 PCR（chasing PCR）,。注意追加 PCR 只做 20 次循環(huán),。

12.追加PCR 結(jié)束后，再電泳檢測(cè),。如果有條帶,，再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率,，可以此輪追加PCR 的產(chǎn)物為模板,，再進(jìn)行下一輪易錯(cuò) PCR。

13.如果沒有預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物,，則需要分析原因,。

選擇我們的染料法實(shí)時(shí)可調(diào)易錯(cuò) PCR 試劑盒,，就是選擇精準(zhǔn),、高效、可靠的檢測(cè)方案,，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航,！