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產(chǎn)品簡介：

分子克隆（Molecular Cloning）是分子生物學(xué)領(lǐng)域的奠基性技術(shù),，它是利用質(zhì)粒作為載體來克隆所需的 DNA 片段,，并利用大腸桿菌作為宿主進行擴增，使 DNA 片段取之不盡,。分子克隆技術(shù)極大促進了生物學(xué)的發(fā)展,，但是，其缺點是耗時并且步驟繁多,，從連接到重組子鑒定一般需要 3-7 天（取決于宿主細(xì)胞）,。為克服此缺點，本公司根據(jù)滾環(huán)擴增原理開發(fā)了本產(chǎn)品,。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用,，十分方便，用戶不需要辛苦摸索條件,。

2.起始材料為 DNA 片段-載體連接產(chǎn)物或 DNA 片段自身環(huán)化產(chǎn)物,，到擴增產(chǎn)物鑒定最快只需要 6 小時完成（擴增 4 小時+酶切鑒定 2 小時）。如果起始 DNA 少,， 則需要更長的時間,。

3.使用自備的 DNA 插入片段專一的引物，只擴增帶有 DNA 插入片段的重組質(zhì)粒,， 不擴增自連載體,。如果連接反應(yīng)時已經(jīng)排除了載體自身環(huán)化，則可以使用本試劑盒提供的 RCA 引物,。

4.適用于任何長度的 DNA,，也適用于對宿主有毒的 DNA 和在宿主細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定的重復(fù) DNA。

5.不需要感受態(tài)細(xì)胞,。

6.所得質(zhì)粒 DNA 沒有任何 RNA,、宿主 DNA 或內(nèi)毒素的污染。

7.高保真,，所得 DNA 跟分子克隆制備的 DNA 一樣的保真率,。

8.所得 DNA 可以直接用于酶切、一代和二代測序,、轉(zhuǎn)染和酵母轉(zhuǎn)化,。酶切和自身環(huán)化后還可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

9.含熒光染料，可以實時檢測擴增的進行,。

10.本產(chǎn)品足夠 50 次 10uL 體系的免克隆質(zhì)粒制備反應(yīng),。

11.通用免克隆質(zhì)粒DNA制備試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝

dNTP-染料混合液75 uL0.5mL 藍蓋管

RCA 專用隨機引物溶液100 uL0.5mL 白蓋管

phi29 DNA 聚合酶,，10U/uL25 uL0.5mL 紅色管

10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液50 uL0.5mL 綠色管

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸,，-20℃保存,有效期為一年。

自備試劑

插入片段專一性引物,、超純水,。

使用方法：

1.用常規(guī)方法進行插入片段和克隆載體的連接。由于本產(chǎn)品基于滾環(huán)擴增,，故只能  擴增沒有切口的環(huán)狀的 DNA,。因此在連接時，需要注意兩點：一是最好通過粘性末端不同或堿性磷酸酶處理載體,，防止載體自連,，這樣就可以使用本試劑盒提供  的 RCA 專用隨機引物，不必再合成插入片段專一的引物,。二是樣本中必須有一條沒有任何切口,，變性后還是環(huán)狀單鏈的 DNA。常規(guī)的 AT 克隆,，由于 PCR 片段的兩個 5’端沒有磷酸化,，所以連接后重組質(zhì)粒的四個切口其實只連接上了兩個，另外兩個并沒有連接上,。這種帶切口的重組質(zhì)粒并不影響轉(zhuǎn)化,，但不能進行RCA 擴增，因為 DNA 變性后兩條 DNA 鏈其實還是線狀 DNA,。所以這種 PCR 片段需要先磷酸化，或者 PCR 的時候就用 5 端磷酸化的引物,，這樣連接后才能用于 RCA 擴增,。

2.按下表設(shè)置 10uL 的環(huán)狀 DNA RCA 反應(yīng)：

成分管 1

（樣本）管 2

（無模板對照）

連接產(chǎn)物，100pg1 uL-

RCA 專用隨機引物溶液2 uL2 uL

自備 DNA 插入片段專一性引物（注）40pmol40pmol

dNTP-染料混合液1.5 uL1.5 uL

10×Phi29 DNA 聚合酶緩沖液1 uL1 uL

加超純水到到水到 9.5 uL加水到 9.5 uL

在 PCR 儀器上 95℃ 3 分鐘,，放室溫待溫度下降到常溫后加入

phi29 DNA 聚合酶,，10U/uL0.5 uL0.5 uL

合計10 uL10 uL

注：自備引物的方向跟常規(guī) PCR 的方向相反，長度只要 6-10 個堿基即可,。使用時必須跟本試劑盒提供的 RCA 專用隨機引物共同使用,。

3.放熒光定量 PCR 儀器上，設(shè)置 30℃保溫 16 小時,，每 10 分鐘設(shè)置成一個循環(huán),， 采集一次 SYBR 通道的熒光信號。由于是實時檢測反應(yīng)，所以反應(yīng)不一定要 16 小時后終止,，可以在擴增曲線進入平臺期后（已經(jīng)沒有新的 DNA 合成）提前結(jié)束,。如果沒有熒光定量 PCR 儀器，則只能電泳檢測或 PCR 檢測是否有擴增,。

4.典型實驗結(jié)果,。有擴增的樣本將有平緩的 S 熒光曲線，無模板對照將沒有此標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線（見下圖）或擴增曲線：

5.65℃保溫 10 分鐘滅活 phi29 DNA 聚合酶,。由于 phi29 DNA 聚合酶有很強的 3-5 外切酶活性,，因此必須滅活，否則它將逐漸降解已經(jīng)合成的 DNA,。

6.擴增所得質(zhì)粒 DNA 為超分支結(jié)構(gòu),，直接電泳就是模糊一片，并不能進行分析鑒定,。因此必須先酶切再電泳,。可以選擇跟常規(guī)重組子鑒定一樣的酶進行酶切電泳,，  也可以用菌落 PCR 一樣的方法進行菌落 PCR 來判斷是否克隆成功,。擴增產(chǎn)物也可以直接用于轉(zhuǎn)染、酵母轉(zhuǎn)化,、一代或二代測序,。如果轉(zhuǎn)化大腸桿菌，則需要先用只酶切重組質(zhì)粒一次的限制性內(nèi)切酶酶切,，再自連,，再轉(zhuǎn)化。也可以用超純水將 1uL 擴增產(chǎn)物稀釋 100 倍后再用 1uL 稀釋液作為模板,，再進行 RCA 擴增,，得到更多的 DNA。

選擇我們的通用免克隆質(zhì)粒DNA制備試劑盒,，就是選擇精準(zhǔn),、高效、可靠的檢測方案,，為您的科研實驗保駕護航,！