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產(chǎn)品簡介：

本試劑盒是基于 Inoue 方法的,、高效快速 E.coli 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.一步式操作,，離心后重懸細(xì)胞即可,，非常簡單。

2.轉(zhuǎn)化率高,，轉(zhuǎn)化效率一般都在 10E8/ug 質(zhì)粒以上,。

3.重復(fù)性好，可用于各種 E.coli 菌種,，包括 K12 系（如 JM109,、DH5a 等）和

B 系（如 BL21 系列菌種）。

4.適用于低,、中,、高拷貝的各種質(zhì)粒。

5.本試劑盒足夠 20 次制備,，每次可以制備可以用 50 mL 菌液制備 80 管感受態(tài)細(xì)胞,。所得感受態(tài)細(xì)胞在-80℃至少可以保存半年以上。

6.高效E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒只能用于科研,。

產(chǎn)品參數(shù)：

名稱規(guī)格包裝

E.coli 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備

溶液A250 mL×2250mL 本色瓶

E.coli 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備

溶液 B6 mL10mL 本色瓶

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸,，4℃保存（開封后請-20℃保存，防止污染）,，有效期一年,。

自備試劑

無菌超純水,，SOB 和 SOC 液體培養(yǎng)基，相關(guān)抗菌素,，溫控?fù)u床,。

使用方法：

1.劃盤，過夜培養(yǎng)出單菌落,。

2.次日下午,，接種一個單個直徑為 2-3 毫米的菌落到 1 mL 不含抗生素的 SOB

液體培養(yǎng)基中，37℃ 220rpm 搖晃過夜培養(yǎng),。

3.次日早上,，將 20 uL 上步得到的菌液接種到 2 mL SOB 液體培養(yǎng)基中，37℃

250-300 rpm 搖晃培養(yǎng) 3 小時,。此時菌液將輕微渾濁,。

4. 將 1 mL 上步得到的菌液接種到 50 mL SOB 液體培養(yǎng)基中（用 250 mL 三角瓶），用戶也可以分別接種 1 mL,，0.5 mL 和 0.25 mL 到 3 個 50 mL 的 SOB液體培養(yǎng)基中,，這樣 2-3 小時測 OD 時總有一瓶 OD 會在 0.3-0.4，避免了多次測 OD 可能帶來的污染,。

5.  室溫或 18℃ 250-300 rpm 搖晃培養(yǎng) 2-3 小時,，直到 OD600 在 0.3-0.4 之間。注意：確保室溫或 18℃培養(yǎng)非常重要,，在此溫度下細(xì)菌 OD600 達(dá)到0.3-0.4 所需時間跟菌種不同而不同,。

6. 將菌液放置在冰上 10 分鐘。同時預(yù)冷下步要用的 50 mL 無菌離心管和 20 mL溶液A,。所需冷凍離心機也最好開啟制冷,。

7.將 50 mL 菌液轉(zhuǎn)移到 2 個預(yù)冷的無菌離心管中，每管 25mL,。在冷凍離心機上 4oC 3000g 離心 10 分鐘,，棄上清。注意：必須低溫離心,，否則轉(zhuǎn)化效率將減低 100 倍,。

8.再在 4oC 3000g 短暫離心半分鐘，用移液槍小心吸出殘留液體,。注意：殘留上清必須徹-底去除,，否則會影響感受態(tài)效率。

9.在沉淀中加入 20 mL 預(yù)冷的溶液 A,，輕彈離心管底輕柔重懸菌體,。注意：不要渦旋振蕩。

10.冰上放置 5 分鐘。期間預(yù)冷 4.3 mL 新鮮配制的感受態(tài)活化液（4 mL 溶液A+0.3 mL 溶液 B,，充分混勻后放冰上）和裝感受態(tài)細(xì)胞所需的無菌塑料離心管,。

11.4oC 3000g 離心 10 分鐘，棄上清,。

12.在沉淀中加入 4 mL 第 9 步預(yù)冷的感受態(tài)活化液,，重懸細(xì)菌后冰上放置 10 分鐘。

13.按 50 uL/管分裝到預(yù)冷的無菌塑料離心管中,。此時細(xì)胞將處于感受態(tài),，可以直接用于轉(zhuǎn)化，也可立即放到-80℃保存,。50 mL 菌液一次可以制備 80 管感受態(tài)細(xì)胞,。

二：轉(zhuǎn)化步驟

1.將凍存的感受態(tài)細(xì)胞置于冰中解凍。

2.加入 1-5 uL 質(zhì)粒（100pg-10ng）或 1-5 uL 連接反應(yīng)液,。用加 DNA 的移液器輕柔吹打混勻,，不要渦旋震蕩,。

3.冰浴 15-30 分鐘,。期間可以 37oC 預(yù)熱 1 mL 自備的、不含抗菌素液體培養(yǎng)基

（此處最好用 SOB,，因為 LB 培養(yǎng)基將降低轉(zhuǎn)化率）,。

4.42oC 熱激 60 秒后冰浴 1-2 分鐘。

5.加入 1 mL 37oC 預(yù)熱的不含抗菌素液體培養(yǎng)基后,，37oC 保溫 1 小時,。如能

160~225rpm 振蕩培養(yǎng)更佳。

6.將 50-100 uL 菌液涂布在含適當(dāng)抗菌素的瓊脂平板培養(yǎng)基上,，37oC 過夜培養(yǎng),。

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