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產(chǎn)品簡介：

PCR 標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的 dNTP 進(jìn)行 PCR,，最后得到的 PCR 產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn),。本產(chǎn)品就是基于上述原理的基礎(chǔ)上開發(fā),。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑,，不需要用戶自己摸索,。

2.一次標(biāo)記可以得到µg 級(jí)的雙鏈 DNA 探針或約 700ng 的單鏈 DNA 探針， 足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用,。

3.既可用于制備雙鏈探針,，也可以用于單鏈探針。

4.A 型需自備含標(biāo)記核苷酸的 dNTP,，B 和 C 型分別含生物-素和地高-辛標(biāo)記的底 物 ,。 可 用 的 自 備 標(biāo) 記 底 物 包 括  fluorescein-dUTP 、 hydroxycoµmarin-dUTP,、resorµfin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等,。

5.摻入率一般為 4-5%，有效降低了空間阻礙，檢測(cè)效果-最-佳,。

6.標(biāo)記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot,、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析,。

7.足夠 10 次 50 µL 體系的常規(guī) PCR（用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì)照反應(yīng)）和 5 次 50 µL 體系的標(biāo)記反應(yīng),。

8.PCR法DNA探針標(biāo)記試劑盒（不含標(biāo)記底物）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

名稱規(guī)格包裝

標(biāo)記專用 PCR Mix(含酶)500 µL0.5 mL 紅蓋管

dATP,，10 mM each50 µL0.5 mL 白蓋管

dTTP,，10 mM each50 µL0.5 mL 綠蓋管

dGTP，10 mM each50 µL0.5 mL 黃蓋管

dCTP,，10 mM each50 µL0.5 mL 本色蓋管

使用手冊(cè)1 份無

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，有效期一年,。

自備試劑

DNA 模板和模板專一性引物，常規(guī) PCR Mix,。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作

1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì) PCR 引物,，使 PCR 產(chǎn)物（探針）長度在 400-800bp 之間。過短則地高-辛標(biāo)記摻入少,，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱,；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng),。

2.為保證成功率,，最好先用常規(guī) PCR 產(chǎn)物制備 DNA 片段，再以之為模板進(jìn)行標(biāo)記 PCR 反應(yīng),。不推薦以基因組 DNA 或其他背景復(fù)雜的 DNA 為模直接進(jìn)行 PCR 標(biāo)記反應(yīng),。

3.四種 10mM 的 dNTP 是分開提供，用于制備 50µL 非標(biāo)記 dNTP（2mM each,，用于非標(biāo)記PCR,，用于制備標(biāo)記PCR 的模板。配制方法是四種10mM的dNTP 各加 10µL,，再加水 10µL 即可）和 25µL 標(biāo)記dNTP（2mM each,，其中標(biāo)記核苷酸和對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸的比例需要自行優(yōu)化，假如是 biotin或 DIG 標(biāo)記的是 dUTP,，則其對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸是 dTTP,，兩者的最佳比例一般為 1：3；如果是 BrdUTP,，則兩者的最佳比例為 1：1,。配制方法是三種 10mM 的 dNTP 各加 5µL，再加標(biāo)記核苷酸和其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記核苷酸使其總的終濃度為 2mM,，再補(bǔ)水到 25µL 即可）,。

二：非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物的制備

1.設(shè)置 50µL 非標(biāo)記 PCR：2×標(biāo)記專用 PCR Mix 25 µL,，dNTP Mix（2mM each）5µL，自備的探針引物（10pmol/µL）各 1µL,，1 µg 基因組 DNA或 1ng 質(zhì)粒 DNA,，補(bǔ)超純水到 50µL。

2.按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進(jìn)行常規(guī) PCR,。

3.膠回 PCR 產(chǎn)物并定量,，膠回收可以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記 PCR。

三：標(biāo)記 PCR 反應(yīng)

注意：由于雙鏈 PCR 探針在雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性,，降低雜交效

率,，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記 PCR。

成份樣品非標(biāo)記對(duì)照

2×標(biāo)記專用 PCR Mix25 µL25 µL

含標(biāo)記核苷酸的 dNTP Mix（自備）5 µL不加

dNTP Mix,，2mM不加5 µL

若單鏈標(biāo)記：加探針引物其一50 pmol50 pmol

若雙鏈標(biāo)記：加探針引物一和引物二各 50 pmol各 50 pmol

膠純化所得 PCR 產(chǎn)物（單鏈標(biāo)記可用

100ng 模板）10 ng10 ng

超純水補(bǔ)到 50 µL補(bǔ)到 50 µL

1. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記 PCR,，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產(chǎn)物,，探針對(duì)擴(kuò)增長度完整性要求不高（長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),，效果反而更好），所以可以增加循環(huán)數(shù),；二是延伸時(shí)間增加 15 秒,，因?yàn)闃?biāo)記 dµTP 參入到 DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢；三是降低復(fù)性溫度 5-7℃,，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到 DNA 后,，新模板的 Tm 值將降低。

2. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)液和對(duì)照反應(yīng)液 1-5 µL,，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的 DNA Marker 一起電泳,，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記產(chǎn)物中額外帶有生物-素,，地高-辛等,、其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物（但同位

素標(biāo)記不能用此法）。下圖是一個(gè)典型的雙鏈 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖：

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