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產(chǎn)品簡介：

miRNA 純化試劑盒（過柱法）是用于小 RNA 分離純化產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點：

1.一步法直接分離純化小 RNA,，比兩步法（先分離總 RNA 和再純化其中的小 RNA）和 PAGE 電泳回收法更簡單,。得到的小 RNA 長度大部分在 200 nt 以下,，包括5S RNA,、tRNA,、miRNA、Pre-miRNA,、pri-miRNA,、siRNA、shRNA 和 snRNA等,。

2.柱式操作,，整個過程只需要 10 多分鐘。

3.適用范圍廣,，可以用于動物組織,、血液及部分植物組織等實驗材料。

4.得到的小 RNA 純度高,，OD260/280 一般都在 1.9 以上,。

5.產(chǎn)率一般為 20-40 μg/100 mg 動物組織,。

6.無基因組 DNA 的污染,。

7.可用于 RT-PCR、miRNA 標(biāo)記,、microarray 等后續(xù)實驗,。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份規(guī)格包裝材料

miRNA 純化溶液 A25 mL30 mL 棕色玻璃瓶

miRNA 純化溶液 B25 mL30 mL 本色瓶

miRNA 純化溶液 C50 mL60 mL 本色瓶

離心吸附柱50 套×2塑料袋

miRNA 專用洗柱液50 mL60 mL 本色瓶

RNA 洗脫液10 mL10 mL 本色瓶

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

常溫運輸和保存,，有效期一年。

自備試劑

氯仿,。

使用方法：

由于離心吸附柱的吸附量限制,，本產(chǎn)品每次提取只能處理 100 mg 左右的各種組織。如果處理樣品量大,，請分成很多相當(dāng)于微量提取的量進行,，最后再收集在一起。

1.  新鮮配制裂解液,。將 miRNA 純化溶液 A 和 miRNA 純化溶液 B 按 1:1 的比例混合,，然后根據(jù)組織細胞類型的不同分為下面及種情況使用。注意：miRNA 純化溶液 A 和 miRNA 純化溶液 B 混合后必須立即使用,，不要放置,，否則會產(chǎn)生沉淀。

a)對貼壁細胞：吸盡培養(yǎng)液,，在每 10 平方厘米細胞中加入 1 mL 新鮮配制的裂解液,，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細胞全部裂解,。

b)對懸浮細胞：離心收集細胞,，吸盡液體，在每 1-5×106 懸浮細胞中加入 1 mL

新鮮配制的裂解液,，用槍輕柔吹打數(shù)次,，確保細胞全部裂解。如果是 fibroblasts

或 carcinoma cell,，1 mL 新鮮配制的裂解液的細胞使用量不要超過 1×106個細胞,。

c)對新鮮的動物或植物實體組織：勻漿法：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中，每 50-100 mg 組織加 1 mL 新鮮配制的裂解液,，用剪切式勻漿機勻漿 30 秒左右,。對肝、脾,、胰,、腎等細胞分裂十分旺盛的組織（細胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），建議組織的使用量不要超過 50 mg/mL 裂解液,，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染,。液氮研磨法：將組織在液氮中研磨成粉，然后轉(zhuǎn)移到新配制的裂解液中,，震蕩混勻,。

d)對在 RNA 非凍型保存液中保存的動物或植物實體組織組織：先用紙吸去保存液后再剪切成小塊，再按新鮮實體組織的處理方法處理。

2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個干凈的 1.5 mL 塑料離心管中,，然后加入 0.2 倍體積的自備氯仿(1 mL 裂解物需 0.2 mL 氯仿),，振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。

3. 14,000×g 室溫離心 3-5 分鐘,。

4.將上清液（約 0.6-0.8 mL）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中,。注意：離心后下層有機相和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及,，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染,。為保險起見，可以留下 100 μL 上清液不取,。同時吸取上清時最好緩慢進行,，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀 DNA。

5.14,000×g 室溫離心半分鐘,，收集管中的穿透液,。大 RNA 及 DNA 將與離心吸附柱的膜結(jié)合，小 RNA 將存在于穿透液中,。但由于離心吸附柱的最大吸附能力為 40 μg 動物 RNA,，20 μg 植物 RNA，所以如果樣品中的大 RNA 含量高于上面數(shù)值,，則需要減少上樣量,，否則穿透液中將同時含有大 RNA 和小 RNA。

6.在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等體積的 miRNA 純化溶液 C,，混勻,。此時溶液的總體積約 1.5 mL。

7.先轉(zhuǎn)移約 0.75 mL 到離心吸附柱中,，14,000×g 室溫離心半分鐘,，棄收集管中的穿透液。

8.將上步上柱剩余的樣品轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中,，14,000×g 室溫離心半分鐘,，棄收集管中的穿透液。

9.加 0.7 mL miRNA 專用洗柱液到離心吸附柱中,，14,000×g 室溫離心半分鐘,，棄穿透液。

10.加 0.3 mL miRNA 專用洗柱液到離心吸附柱中,，14,000×g 室溫離心半分鐘,，棄穿透液。此步一般可以省略,。

11.14,000×g 室溫離心半分鐘以甩出殘聯(lián)液體,。此步十分重要,，否則殘留的miRNA 專用洗柱液會影響 miRNA 的使用。

12.將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的RNase-free 收集管中,，加入 50 μL RNA 洗脫液，室溫放置 3-5 分鐘,。

13.14,000×g 室溫離心半分鐘,，離心管中溶液即為 miRNA 樣品，可以立即使用

或存放于-80℃待用,。

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