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產(chǎn)品簡介：

確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點和終止位點是研究基因結構和功能的最重要工作之一，最-通用的方法是 Frohman 發(fā)明的 Rapid Amplification of cDNA Ends,。其用于確定轉(zhuǎn)錄起始位點的方法叫 5′ RACE 法,，用于確定轉(zhuǎn)錄終點的方法叫 3′ RACE 法。它們是通過PCR 快速克隆 cDNA 末端,，在不建立 cDNA 文庫的前提下,，利用已知 cDNA 序列設計引物，通過向 mRNA 兩端延伸和擴增獲得兩個末端的序列,。本試劑盒就是根據(jù) RACE 技術開發(fā)的確定mRNA 5′末端的試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用,，客戶只需要準備總 RNA（或 mRNA）和專一性引物,，不用準備其他試劑。

2.反應條件經(jīng)過精心優(yōu)化,，不需要用戶辛苦摸索條件,。

3.本產(chǎn)品足夠 10 次 5′ RACE 實驗,。

4.改良 5′ RACE 試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

成分 規(guī)格包裝

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合液 20 μL0.5 mL 藍蓋管

MMLV Buffer-dNTP 混合液 50 μL0.5 mL 黃蓋管

微量核酸沉淀劑 400 μL0.5 mL 綠蓋管

2×TdT Buffer（含 dATP） 200 μL0.5 mL 橙蓋管

TdT（末端轉(zhuǎn)移酶） 10 μL0.5 mL 紅蓋管

2×PCR MasterMix 1 mL×21.5 mL 本

5′ RACE 引物 A-

引物 B 混合干粉 10 次0.5 mL 紫

5′ RACE 引物 C 干粉 10 次0.5 mL 白

RNase-Free 水1 mL1.5 mL 亮

使用手冊 1 份無

運輸及保存

低溫運輸,、-20℃保存,、有效期一年。

自備試劑

mRNA（或總 RNA）,、基因?qū)Ｒ恍砸?A,、B、C,、75%乙醇,。注意：自備的基因?qū)Ｒ恍砸顰，B,，C 的相對位置必須跟本手冊產(chǎn)品介紹中的示意圖一致,。

使用方法：

1.變性模板 RNA：將 1 μg mRNA 或 5 μg 總 RNA 加入到一個 RNase-Free 的塑料管中，補 RNase-Free 水到 11 μL,，65℃保溫 5 分鐘打開 RNA 的二級結構后短暫離心,，立即放冰上待用。如果 RNA 濃度偏低,，加 RNase-Free 水之前體積就已超過10 μL,則需要使用核酸濃縮劑（需另購）濃縮到所需的體積,。

2.在塑料管中按順序加入：2 μL 自備的基因?qū)Ｒ恍砸顰（濃度為 10 μM），5 μL MMLV Buffer-dNTP 混合液,，2 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶-RI 混合液,，總體積為 20 μL，輕柔吹打混勻,。

3. 37℃保溫 60 分鐘,，42℃保溫 30 分鐘，50℃保溫 10 分鐘,，最后 75℃保溫 10 分

鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶變性,，短暫離心 5 秒后待用。

4.在塑料管中加入 40 μL 微量核酸沉淀劑（含不溶的核酸助沉劑,，用前需要充分搖勻再取用）,，震蕩混勻。

5.室溫 12000×g 離心 15 分鐘,，沉淀即為 cDNA,。小心吸棄上清。此步沉淀可以去除多余的 dNTP,，它們會嚴重干擾后續(xù)的 TdT 加尾反應,。

6.加入 1 mL 自備 75%乙醇，室溫 12000×g 離心 5 分鐘,，小心吸棄上清,。此步洗滌可以洗去逆轉(zhuǎn)錄反應中殘留的dNTP,，它們會嚴重干擾后續(xù)的 TdT 加尾反應。

7.短暫離心數(shù)秒,，小心吸棄殘留液體（約 50 μL）,，晾干 2 分鐘。

8.加入 20 μL RNase-Free 水,，充分吹打溶解 cDNA 沉淀,。注意：為保證加尾效率，溶解 cDNA 的 RNase-Free 水最好不要超過 20 μL,，否則 cDNA 模板濃度太稀,。

9.在兩個塑料離心管中按下表設置加尾反應：

成分加尾樣品管加尾陰性對照管

cDNA溶液（上步所得）9 μL9 μL

2×TdT Buffer（含dATP）10 μL10 μL

RNase-Free水不加1 μL

TdT酶1 μL不加

10.37℃保溫 15 分鐘進行加尾反應，然后 75℃保溫 3 分鐘滅活末端轉(zhuǎn)移酶,。

11.在兩個反應管中各加入 0.5 mL RNase-Free 水稀釋樣品,，此 250 倍稀釋液將作為下步PCR 的模板。

12.第一輪 PCR：按下表分別使用不同體積的樣品稀釋液設置四個 50 μL 的PCR 反應,，客戶還需要按下表設置四個以陰性對照稀釋液做模板的PCR 反應,，只是將表中的樣

品管稀釋液改成陰性對照稀釋液。共 8 個PCR 樣品,。

成分梯度1梯度2梯度3梯度4

PCR MasterMix25 μL25 μL25 μL25 μL

自備基因?qū)Ｒ恍砸?B（10 μM）  2.5 μL   2.5 μL   2.5 μL    2.5 μL 5′ RACE 引物 A-引物B 混合液     2.5 μL   2.5 μL   2.5 μL    2.5 μL樣品管稀釋液1 μL     5 μL     10 μL    15 μL

RNase-Free 水19 μL    15 μL    10 μL     5 μL

13.按下列條件進行 PCR（注：應根據(jù)自備引物的 Tm 值選擇適當?shù)耐嘶饻囟?，下面的參?shù)僅僅供參考）。

第 1 次循環(huán)：94℃ 5 min,，48-52℃ 2 min,，72℃ 4 min

第 2-30 次循環(huán)：94℃ 40 sec，52-60℃ 1 min,，72℃ 3 min

最后延伸：72℃ 15 min

14.直接取 20 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢查 PCR 結果(樣品組 4 個樣,，陰性對照組 4 個樣)。如果樣品有一條清晰的擴增條帶,，并且陰性對照在相應的位置沒有擴增產(chǎn)物,，則可以不做后續(xù)的第二輪PCR，直接進行 DNA 測序或切膠克隆,。如樣品沒有任何一條清晰的擴增條帶,，則進入第二輪 PCR。

15.第二輪 PCR：從 8 管PCR 產(chǎn)物中各取 1 μL 分別加入到 20 μL RNase-Free 水中進行稀釋 20 倍,，再各取 1 μL 分別作為第二輪PCR 的模板,，再加入 25 μL PCR MasterMix，2.5 μL 5′ RACE 引物 C,，2.5 μL 自備基因?qū)Ｒ恍砸?C（10 μM）,，補水到共 50 μL 。

16. 按下列條件進行 PCR：第 1-30 次循環(huán)（94℃ 40 sec，52-60℃ 1 min,，72℃ 3

min），最后延伸：72℃ 15 min

17. 直接取 20 μL PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,，一般會有至少一個樣品有清晰的條帶出現(xiàn),，則可以直接進行DNA 測序或 TA 克隆。

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