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產(chǎn)品簡介：

菌落 PCR 是篩選重組子的有效方法,，可以使質(zhì)粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時,。但如果宿主是酵母，其菌落 PCR 的難點則是破壁,，因為酵母的細(xì)胞壁比細(xì)菌堅韌許多,。本產(chǎn)品是基于玻璃珠破壁方法而開發(fā)的酵母菌落 PCR 產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點：

1.破壁效率高,，甚至可以用于野生型酵母,。

2.既可用酵母菌落，也可用酵母培養(yǎng)液,。

3.條件溫和,，菌落 PCR 可以擴(kuò)增長達(dá) 3 kb 的 DNA。

4.既可小規(guī)模篩選,，也適用于大規(guī)模篩查,。

5.高靈敏度，既可用于擴(kuò)增酵母質(zhì)粒,，也可以用于擴(kuò)增酵母基因組 DNA,。

6.PCR 反應(yīng)液中含有惰性電泳染料，反應(yīng)后可直接上樣電泳,，不需另加上樣液,。

7.處理過的酵母菌落樣品低溫長期保存后仍能用于 PCR 篩查。

8.酵母菌落PCR試劑盒足夠 100 次 60 μL 體系的酵母菌落 PCR（細(xì)菌菌落 PCR 需要用另一款產(chǎn)品）,。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份 規(guī)格包裝

酵母破壁液 2×1 mL1.5 mL 綠蓋管

2×PCR MasterMix

（菌落篩選專用） 2×1.5 mL1.5 mL 紅蓋管

酸洗玻璃珠400-600 μm 3 g2.0 mL 本色管

使用手冊 1 份1 份

運輸及保存

低溫運輸,，-20℃保存，保存期限為一年,。

自備試劑

酵母菌落,，模版專一性引物，TE 緩沖液,。

使用方法：

一,、 酵母破壁

1.如果有 N 個樣本，則標(biāo)記 N+2 個 1.5 mL 的塑料離心管,，N 個用于樣本,， 一個用于陽性對照 PC（Positive Control，確認(rèn)有質(zhì)粒陽性的樣本）,，一個用于陰性對照 NC（Negative Control,，可以用水代替）。

2.在每個管中加入 20 μL 酵母破壁液。

3.挑入一個新鮮酵母菌落（芝麻大小即可）或 2 μL 酵母飽和菌液,。

4.加入體積跟酵母破壁液相當(dāng)?shù)乃嵯床Ａе椋ㄖ亓吭?20-30 mg）,。

5.渦旋震蕩 3 分鐘。

6.常溫 10000 rpm 離心半分鐘后可以直接取上清作為模板立即進(jìn)行 PCR,。如果不立即進(jìn)行PCR,，需將上清全部轉(zhuǎn)移到新離心管中（至少可以取出 15 μL），再加入等體積的自備 TE 緩沖液,，放-20℃待用,。TE 緩沖液中的 EDTA 可以抑制樣本中殘留 DNase 的活性，可以使 DNA 的放置時間更長,。

二,、PCR 擴(kuò)增

7. 在一個 1.5 mL 的預(yù)冷塑料離心管中分別加入下列預(yù)冷成份并充分混勻 ， 得到 PCR 預(yù)混液并放冰上待用,。由于有 N+2 個樣本,，所以配制時多加一個， 按 N+3 計算：

7.將上步得到的預(yù)冷 PCR 預(yù)混液按 59 μL/管分裝到 N+2 個標(biāo)記并且預(yù)冷的 PCR 管中,。

8.將第 6 步制備的N+2 個樣品各取 1 μL 加入上步加有 59 μL 混合液的 PCR管中,。PC 樣到 PC 管，NC 樣到 NC 管,，1 號樣品加入到 1 號 PCR 管中,，以此類推。由于裂解液含大量 PCR 抑制物,，樣本用量不要超過 1.5 μL,，否則樣本加得越多，PCR 越容易被抑制,。

9.將 N+2 個預(yù)冷的 PCR 管快速放入 PCR 儀器中進(jìn)行擴(kuò)增,，PCR 溫度參數(shù)根據(jù)引物和模板情況由客戶自己預(yù)先確定。

10.PCR 結(jié)束后直接取 10 μL 電泳直接進(jìn)行瓊脂糖電泳分析,。本試劑盒提供的 PCR MasterMix（菌落篩選專用）中已經(jīng)含有電泳示蹤劑和促沉劑,，故可以直接上樣。橙黃色電泳染料的泳動速度對應(yīng)于 50 bp 的 DNA,，藍(lán)色電泳染料的泳動速度對應(yīng)于 3-5 kb 的 DNA,。

11.如果陰性對照 NC 有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物,，則無論陽性對照 PC 和 N 個樣本的結(jié)果如何,，整個實驗無效。說明環(huán)境污染,，需要解決污染問題再繼續(xù),。  如果陽性對照 PC 沒有預(yù)期大小的片段，且沒有任何樣本呈現(xiàn)陽性，則很可能是試劑,、程序,、引物、儀器等有問題,，需要解決問題后再繼續(xù),。如果有任 何一個樣本呈現(xiàn)陽性（不包括陰性對照），則實驗有效,，可以繼續(xù)分析每個樣  品,。

12.如果陽性對照有預(yù)期大小的片段，陰性對照沒有,，則整個實驗有效,。可以分析每個樣品,。每個樣品如果有預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物,，則初步判斷為陽性。  如果沒有,，則判斷為陰性,。

13.對陰性樣本，可以用超純水將其稀釋 10 倍,、百倍,、千倍、萬倍 4 個稀釋度,， 然后一起再進(jìn)行 PCR 檢測,，如果某個稀釋度的樣本出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物，則測試時需要先將樣本稀釋到該稀釋度后再測,。

14.可以將陽性樣品對應(yīng)的菌落再挑出來進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行進(jìn)一步的分析,。

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