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產(chǎn)品簡介：

本試劑盒是基于 SP6 RNA 聚合酶的帶帽 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒,，它利用含有SP6 啟動子的模版 DNA,，以 NTP 和m7G(5' )ppp(5' )G 為底物,，從 SP6 啟動子 下游開始合成與模版 DNA 中一條鏈互補的 RNA,，簡單快速獲得大量的 RNA 分子,。同時這些 RNA 中有部分 RNA 的 5′ 端含有 m7G 帽結(jié)構(gòu),。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用,，用戶只需提供含 SP6 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉(zhuǎn)錄實驗。

2.體外轉(zhuǎn)錄和加帽同管一步式進行,，不需要先體外轉(zhuǎn)錄再加帽,。

3.單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù),，避免了操作誤差,，增加了可重復(fù)性。

4.模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒DNA,，也可以是 PCR 擴增產(chǎn)物,。

5.可以合成的 RNA 的最佳長度在 20nt 到 2000 nt 之間。

6.產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化,，每?g DNA 模版可以合成 2-6 ?g RNA,。

7.得到的加帽 RNA 比不加帽的 RNA 更穩(wěn)定，可以用于RNA 結(jié)構(gòu)研究,、核酶生物化學(xué),、體外翻譯,、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù),、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實驗,。

8.SP6體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒足夠 5 次 20 ?L 的體外轉(zhuǎn)錄實驗。本產(chǎn)品只能用于科研,。

產(chǎn)品參數(shù)：

成份 規(guī)格 包裝

2×SP6 體外轉(zhuǎn)錄及加帽預(yù)配液50 μL0.5 mL 本色管

SP6 RNA 聚合酶-RI 混合液10 μL0.5 mL 紅蓋管

RNase-free 水1 mL1.5 mL 藍蓋管

使用手冊1 份無

保存和運輸

低溫運輸,，-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑

如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板,，則需要自備 RNase-free DNase,、Tris 飽

和酚、氯仿,、微量核酸沉淀劑,、RNase-free 75%乙醇。（均可從本公司另購）

使用方法：

一,、制備 DNA 模板

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板,，但是必須注意以下幾點。一是必須使用線性化的 DNA,。如果是質(zhì)粒 DNA,，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 SP6 啟動子,。如果模板是PCR 產(chǎn)物,，則可以在設(shè)計引物時將 SP6 啟動子序列（5’ATT TAG GTG ACA CTA TAG AGN G 3’）加上，轉(zhuǎn)錄其實是從 3 端G AGN G 中的第一個 G 開始,。如果是將 DNA 片段克隆到載體上,，則需要選擇有 SP6 啟動子的載體，并

且克隆位點必須位于 SP6 啟動子下游,。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端最

好不要是 3’突出,。如果是 3’突出（如選擇了Pst I 來線性化質(zhì)粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修平,。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase,。由于提取質(zhì)粒DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的RNase A 污染,，所以在用作模板前,，最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫,，然后電泳檢測 RNA 是否被降解,，以此判斷純化的 DNA 模板是否有殘留RNase A。

二,、體外轉(zhuǎn)錄及加帽反應(yīng)

1.如果有 N 個樣品,，強烈建議做一個陰性對照,，故共設(shè)置 N+1 個反應(yīng)，這樣一起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA,，哪個條帶是擴增得到的 RNA。在 N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中,，在室溫下（不是在 4℃下）按次序加入下列成分（T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀,，一定要握在手中直到結(jié)晶徹-底溶解并搖勻后方可使用）：

注：此為 20 μL 反應(yīng)體系的用量，對其他反應(yīng)體系,，各成分的用量可以按比例增減,。如果需要標(biāo)記 RNA 探針，則需要單獨訂購 NTP 分開的試劑盒,。

2.37℃保溫 1-2 小時,。注意：延長保溫時間并不能提高產(chǎn)量。

3.70℃加熱 10 分鐘滅活 SP6 RNA 聚合酶,。

4.取 1-3μL 電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果,。此時除 DNA marker 外，最好再用 DNA 模板做電泳對照,。電泳時比陰性對照多出的條帶就是擴增得到的 RNA（由于合成的RNA 長度不均勻,，即使長度均勻，但由于自生形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，泳動速度也不一致,，所以電泳所得 RNA 條帶一般都不是清晰，而是比較彌散的電泳條帶,。但由于 RNA 是單鏈,，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此轉(zhuǎn)錄得到的 RNA 一般比其雙鏈的 DNA 模板電泳速度更快

5.定量,，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度,，也可以肉眼比較電泳膠上 RNA 和 DNA 的強度。由于 RNA 是單鏈,，跟核酸染料結(jié)合力低,，因此同等亮度的 RNA 條帶，其 RNA 分子數(shù)一般比 DNA 的分子數(shù)多一倍,。使用本試劑

盒時 1 μg DNA 模板一般可以合成 2-6 μg 的RNA（部分為 5 端帶帽的RNA）,。

6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存或立即使用。

注：若需進一步去除 DNA 模板,，可參考下列操作步驟,，但所用試劑需另行購買。

1.在體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase（CAT#:90903,； 3-5 U/μL）,。

2.37℃保溫 15-30 分鐘降解 DNA,。

3.補水到 100 μL（體積太小不方便下步的酚氯仿抽提）。

4.用等體積的 Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase 和 RNA 聚合酶,。

5.在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903,；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘,，棄上清,。

6.加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘,，棄上清,。

7.短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清,。

8.晾干半分鐘,，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA?？扇苡?RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長期保存,。

選擇我們的SP6體外轉(zhuǎn)錄及加帽試劑盒，就是選擇精準(zhǔn),、高效,、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航,！