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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea PAGE)是目前分離 200 nt 以下的小片段 RNA,，尤其是 20 nt 左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是單獨(dú)配制各種溶液十分繁瑣,，為此本公司開(kāi)發(fā)了本產(chǎn)品,。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.一站式,，含有電泳所需要的所有試劑，即開(kāi)即用,，十分方便,，免去了實(shí)驗(yàn)  人員稱取有毒物品。

2.靈活,，可以根據(jù)需要配制各種濃度的 Urea-PAGE,，以便對(duì)長(zhǎng)度各異的RNA 進(jìn)行電泳。

3.電泳后可直接用于 UV 觀察,、銀染,、膠回收、Northern 雜交等實(shí)驗(yàn),。

4.使用新型上樣緩沖液,，可以防止甘油的干擾。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

本產(chǎn)品第一部分為大紙盒包裝,，常溫運(yùn)輸

成份規(guī)格包裝

尿素105 g×2250 mL 本色瓶

丙烯酰胺,，電泳級(jí)60 g125 mL 棕色瓶

甲叉雙丙烯酰胺，電泳級(jí)3 g10 mL 棕色瓶

TBE 電泳液,10×250 mL250 mL 本色瓶

TEMED1.5 mL1.5 mL 白蓋管

過(guò)硫酸銨1 g1.5 mL 綠蓋管

固相 RNase 清除劑250 mL250 mL 本色瓶

使用手冊(cè)1 份1 份

成份規(guī)格包裝

2×miRNA 尿素

-PAGE 上樣液1.5 mL1.5 mL 紅蓋管

miRNA 電泳分子量

標(biāo)準(zhǔn)（15-50 nt）150 μL1.5 mL 藍(lán)蓋管

保存和運(yùn)輸

miRNA 尿素-PAGE試劑盒常溫運(yùn)輸和保存,，其中 miRNAon,、miRNA Marker 需要低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，保存期一年。

自備試劑

miRNA 樣品,、RNase-free 水,。

使用方法：

1.準(zhǔn)備工作：用固相 RNase 清除劑清潔工作平臺(tái)

直接將固相 RNase 清除劑原液或 10 倍的新鮮稀釋液噴于臺(tái)面,，5 分鐘后用普通吸水紙擦凈，最后用沾有固相 RNase 清除劑 1000 倍新鮮稀釋液的吸水紙擦凈,，晾干,。

2.準(zhǔn)備工作：用固相 RNase 清除劑清潔玻璃和塑料器皿將器皿浸泡在固相RNase 清除劑的 10 或 100 倍的新鮮稀釋液中，靜置處理 5 分鐘后取出,， 再用固相 RNase 清除劑 1000 倍或 10000 倍新鮮稀釋液浸泡二次以上,， 倒立晾干后備用。

3.配制 1×TBE 電泳液:將適量的 10×TEB 電泳液用 RNase-free 水稀釋 10 倍,，得到 1×TBE 電泳液待用,。此溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，否則易長(zhǎng)菌,。

4.配制 10%過(guò)硫酸銨溶液:精確稱取約 100 mg 過(guò)硫酸銨到一干凈的 1.5 mL 離心管中,，按每 1 mg 過(guò)硫酸銨加 10 μL RNase-free 水的比例加入 RNase-free 水，搖晃溶解待用,。10%過(guò)硫酸銨溶液有效期不要超過(guò)一周,。

5.估計(jì)所需要的凝膠溶液的體積,，一般配制一塊 13 cm×15 cm×0.8 mm的膠需要 15 mL 凝膠溶液，配制一塊 36 cm×45 cm×0.8 mm 的膠需要 120 mL 凝膠溶液,。

6.配制 40%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液：將 3 g 甲叉雙丙烯酰胺全部倒入裝有 60 g 丙烯酰胺干粉的瓶中,，加入 130 mL 自備的 RNase-free水，充分搖晃混勻即得 40%的 Acrylamide/Bis（20:1）溶液,。

7.根據(jù)所需要的凝膠溶液的體積,，在一的干凈的三角瓶中按下表加入各成分

（此處以配制 100 mL Acrylamide/Bis 終濃度為 15%的凝膠為例）:

成份終濃度用量

尿素7 M42 g

40%Acrylamide/Bis 溶液15%37.5 mL

10×TEB 電泳液1×10 mL

補(bǔ) RNase-free 水到 100 mL

注:Acrylamide/Bis 的終濃度需要根據(jù)待分離 RNA 長(zhǎng)度選擇(見(jiàn)下表)。

需分離的 RNA 長(zhǎng)度范圍Acrylamide/Bis 終濃度

6-100 nt20 %

25-150 nt15 %

40-200 nt12 %

8.攪拌并加熱到 40-50℃左右,，直到尿素完-全溶解,。

9.冷卻到室溫后，將三角瓶接上真空系統(tǒng)抽真空處理 10-15 分鐘以充分去除溶液中的氧氣（氧氣會(huì)降低聚合反應(yīng)效率）,。若條件有限,，此步可省略。

10.邊搖晃溶液變加入 50 μL TEMED 和 500 μL10%過(guò)硫酸銨溶液,。注意：如果選擇其他工作濃度的 Acrylamide/Bis,，此二成分的用量不需要隨之改變。但如果配置的凝膠溶液的體積變化,，此二成分的用量要按比例改變,。

11.再充分搖晃約 30 秒后迅速灌膠，然后插入樣品梳,，室溫放置 30-60 分鐘等待膠凝固,。

12.將凝膠板放置在電泳裝置上后，在上下層分別加入適當(dāng)量的 1×電泳緩沖液,。如果不馬上使用,，需要有濕紙將上樣孔端蓋住以防凝膠過(guò)度干燥。

13.拔出梳子后用加樣槍吸取電泳緩沖液,，充分將每個(gè)加樣空中未聚合的Acrylamide/Bis,、尿素和氣泡吹打出來(lái),。

14.在上樣前,，預(yù)電泳 20-30 分鐘以使多余的過(guò)硫酸銨跑出加樣空，同時(shí)還可以使凝膠的溫度升高（到 50℃左右）,，有利于 RNA 變性狀態(tài),。

15.將 5 μL miRNA 樣品與和 5 μL miRNA 電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)（15-50 nt）分別和 5 μL 的 2×miRNA 上樣液混合，70℃保溫 2-3 分鐘后迅速放置在冰上冷卻,，快速離心半分鐘,，放冰上待用?？梢栽黾?miRNA 樣品的用量,，但上液需要等比例增加,。

16.關(guān)電泳儀后開(kāi)始上樣。10 μL 混合液需要全部上樣,。

17.重開(kāi)電泳儀,，對(duì) 13 cm×15 cm 的膠，以 20-30 mA 的電流電泳,，直到紅色染料移動(dòng)到凝膠邊緣為止,；對(duì) 36 cm×45 cm 的膠，則以 50-60 mA 的電流電泳,，直到紅色染料移動(dòng)到凝膠邊緣為止,。

18.染色觀察：將凝膠一面的玻璃板揭開(kāi)，直接用仍然附著在另一玻璃板上的  凝膠進(jìn)行各種染色,，包括銀染（需單獨(dú)購(gòu)買試劑盒）,、EB 染色（每 100 mL 1×TBE 中加 20 μL 10 mg/mL 的 EB 溶液）、克必隆低毒核酸染料染色（每 100 mL 1×TBE 中加 10 μL 低毒核酸染料）,。如果用后兩種染色法染色,，需要在 UV 下觀察并拍照。本產(chǎn)品提供的 miRNA Marker有 5 條帶,，從上到下的長(zhǎng)度分別為：50 nt,、40 nt、30 nt,、20 nt 和 15 nt,。

19.其它

后續(xù)處理（本試劑盒不含所需試劑），流程僅僅供參考,。

miRNA 回收：在 UV 下確定所需要的 miRNA 條帶的位置,，切膠后進(jìn)行膠回收處理（需要單獨(dú)購(gòu)買試劑盒）。

Northern 雜交：UV 觀察后將凝膠中的RNA 電轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜上,，然后進(jìn)行雜交處理,。

放射自顯影：如果 miRNA 樣品電泳前經(jīng)過(guò)同位素標(biāo)記，則將凝膠一面的玻璃板揭開(kāi),，用濾紙將附著在另一玻璃板上的凝膠吸附過(guò)來(lái),，然后包上保

鮮膜，真空抽干,，然后使膠跟 X 光片向?qū)χ眠M(jìn)行放射自顯影,。

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