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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

用 PCR 對(duì) DNA 進(jìn)行生物-素標(biāo)記的原理是用帶生物-素標(biāo)記的 dNTP 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,，這些 dNTP 摻入到PCR 產(chǎn)物中之后,，擴(kuò)增得到的 DNA 片段自然就帶有生物-素標(biāo)記,，可以直接用于雜交試驗(yàn)。本產(chǎn)品就是基于上述原理開(kāi)發(fā)的,。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.一站式,，本試劑盒經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化,，不需要用戶(hù)自己摸索標(biāo)記條件。

2.優(yōu)化的生物-素?fù)饺肼?，能有效降低探針中生?素分子之間的可能空間阻礙,，檢測(cè)效果佳。

3.得到的生物-素標(biāo)記DNA 探針可以用于 Southern 雜交,、Northern 雜交,、原位雜交、菌落雜交和斑點(diǎn)印跡雜交等分析,。

4.既可用于制備雙鏈DNA 探針,，也可以用于制備單鏈 DNA 探針。

5.一次標(biāo)記反應(yīng)可以得到μg 級(jí)的生物-素標(biāo)記雙鏈 DNA 探針或約 700 ng

生物-素標(biāo)記單鏈DNA 探針,，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用,。

6.本產(chǎn)品足夠 5 次生物-素標(biāo)記 PCR 反應(yīng)（50 μL 體系）。

7.DNA 探針生物-素標(biāo)記試劑盒（PCR 法）只能用于科研,。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成份規(guī)格包裝

標(biāo)記專(zhuān)用PCR Mix(含酶)30 μL0.5 mL 紅蓋管

dNTP Mix,，2.5 mM each25 μL0.5 mL 白蓋管

含 Biotin-11-dUTP 的

dNTP，2.5 mM each25 μL0.5 mL 綠蓋管

超純水1 mL1.5 mL 藍(lán)蓋管

使用手冊(cè)1 份無(wú)

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，有效期一年。

自備試劑

無(wú)

使用方法：

DNA 模板和模板專(zhuān)一性引物,，常規(guī) PCR 反應(yīng)所需試劑,，瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒。

一：準(zhǔn)備工作

1.按常規(guī)的方法設(shè)計(jì)PCR 引物,，使 PCR 產(chǎn)物（探針）長(zhǎng)度在 400-800 bp

之間,。過(guò)短則生物-素標(biāo)記摻入少，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱,；過(guò)長(zhǎng)則非特異雜交增加,，背景變強(qiáng)。

2.為保證成功率,，最好先用常規(guī) PCR 產(chǎn)物制備 DNA 片段,，再以之為模板進(jìn)行標(biāo)記PCR 反應(yīng)。不推薦以基因組 DNA 或其他背景復(fù)雜的 DNA 為模板直接進(jìn)行 PCR 標(biāo)記反應(yīng),。

二：用常規(guī)PCR 制備模板

3.用自備的 PCR 試劑盒按下表配置 50 μL 的常規(guī) PCR 反應(yīng)以制備標(biāo)記

PCR 模板：

成份加入量

自備的 2×PCR Mix（含酶,，含 dNTP）25 μL引物一和引物二（10 pmol/μL）各 5 μL

1 μg 基因組 DNA 或 1 ng 質(zhì)粒 DNA1 μL

超純水補(bǔ)到 50 μL

4.按引物 Tm 值設(shè)計(jì)的PCR 參數(shù)進(jìn)行常規(guī)PCR。

5.用自備膠回收試劑盒回收常規(guī)PCR 產(chǎn)物并定量,。膠回收步驟可以去殘留引物,，避免這些引物干擾后續(xù)的標(biāo)記 PCR 反應(yīng)。

三：標(biāo)記 PCR 反應(yīng)

注意：由于雙鏈PCR 探針在雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性，降低雜交效率,，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記 PCR,。在設(shè)置標(biāo)記 PCR 時(shí)必須做一個(gè)

常規(guī)PCR 對(duì)照（本試劑盒足夠 5 次標(biāo)記 PCR 實(shí)驗(yàn)）。

成份標(biāo)記PCR常規(guī)PCR（自備）

標(biāo)記專(zhuān)用PCR Mix（含酶）6 μL6 μL

含 Biotin-11-dUTP 的

dNTP,，2.5 mM each5 μL不加

dNTP Mix,，2.5 mM each不加5 μL

若雙鏈標(biāo)記，加引物一和引物二,；

若單鏈標(biāo)記,，只加一條引物

各 50 pmol

各 50 pmol

膠回收所得 PCR 產(chǎn)物10 ng（對(duì)雙鏈標(biāo)記）

100 ng（對(duì)單鏈標(biāo)記）10 ng（對(duì)雙鏈標(biāo)記）

100 ng（對(duì)單鏈標(biāo)記）

超純水補(bǔ)到 50 μL補(bǔ)到 50 μL

6.由于此步所用的 PCR 引物和第 3 步的 PCR 引物完-全一樣，故可以參考第 3 步PCR 參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記 PCR,，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個(gè)循環(huán),，使擴(kuò)增得到的探針 DNA 片段參差不齊，雜交時(shí)這種DNA 能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),，雜交效果比長(zhǎng)度整齊的 DNA 更好,；二是延伸步驟的時(shí)間增加 15 秒，因?yàn)闃?biāo)記 dUTP 摻入到DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢,，增加延伸步驟的時(shí)間可以保證更多的標(biāo)記 dUTP 摻入到合成的DNA 探針中,；三是降低復(fù)性溫度 5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸摻入到 DNA 后,，含標(biāo)記核苷酸的 DNA 的 Tm 值將比正常的DNA 低,。

7.PCR 結(jié)束后，取標(biāo)記 PCR 反應(yīng)液和對(duì)照反應(yīng)液 3-5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠

電泳（一定要使用濃度已知的 DNA marker）,，檢測(cè)標(biāo)記是否成功,。由

于標(biāo)記 DNA 含有額外的標(biāo)記物、分子量更大,，其泳動(dòng)速度將慢于常規(guī)PCR 產(chǎn)物,。下圖是一個(gè)典型的雙鏈標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物和常規(guī) PCR 產(chǎn)物電泳速度差異的比較圖：

標(biāo)記的 DNA（右）與未標(biāo)記的 DNA（左）電泳比較

8.探針的定量：電泳所用的DNA marker 濃度已知（如果不確定,，可以問(wèn)供應(yīng)商）,，上樣體積已知,，故上樣量已知,，就可通過(guò)雙鏈探針 DNA 和DNA marker 對(duì)應(yīng)條帶的相對(duì)亮度來(lái)估計(jì)探針 DNA 濃度,。例如,，如果探針長(zhǎng)度為 500 bp,，而 marker 中 500 bp 這條帶的濃度是 10 ng/μL,，共上樣 10 μL,，則 500 bp 這條帶的上樣量為 100 ng。標(biāo)記的探針 DNA在紫外下亮度只有它的一半,，則探針 DNA 的上樣量為 100/2=50 ng,， 如果上樣量是 5 μL，則探針的濃度是 50/5=10 ng/μL。但是,，如果制備的是單鏈 DNA 探針,，則不能按此法估計(jì)濃度，因?yàn)閱捂?DNA 結(jié)合核酸染料（如 EB 和 SYBR GreenI）的能力遠(yuǎn)低于雙鏈 DNA,。但可采用銀染法定量（跟marker 比較）,。一般 100 ng 模板經(jīng)單鏈標(biāo)記 PCR 擴(kuò)增可得到 700 ng 左右的單鏈探針。

9.單鏈 PCR 標(biāo)記產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接加到雜交液中,，雙鏈 PCR 標(biāo)記產(chǎn)物需加熱到 95-100℃ 5 分鐘變性然后放冰上急冷后再加到雜交液中使用,。

10.如果探針不立即使用，需要放-20℃長(zhǎng)期保存,，不能放常溫保存,，否則 Taq DNA 酶的殘留的外切酶活性會(huì)降解探針 DNA。如果需要純化探針 DNA,，請(qǐng)使用本公司的核酸探針純化試劑盒（排阻層析法）,。

選擇我們的DNA 探針生物-素標(biāo)記試劑盒（PCR 法），就是選擇精準(zhǔn),、高效,、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航,！