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產(chǎn)品簡介：

RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）含有熒光 RT-LAMP 擴增所需的所有成分， 可以用于實時熒光 RT-LAMP 等溫擴增,。 RT-LAMP 即 Revers Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification（逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導等溫擴增）,，它利用 4 條模板專一的特異引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和具有鏈置換能力的 Bs DNA 聚合酶,，在等溫條件下(65℃左右)30－60 分鐘完成逆轉(zhuǎn)錄和 LAMP 擴增該技術(shù)在靈敏度,、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于定性 RT-PCR 技術(shù)，還不需要昂貴的儀器設(shè)備,。目前已成功應用于生物的快速檢測,，廣泛用于各  個領(lǐng)域。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用,，含有 LAMP 專用的熒光染料,，可以進行實時熒光檢測（需要熒光 PCR 儀），但不建議用于定量分析,。

2.含 UNG 防污染系統(tǒng),。

3.高特異性，精心優(yōu)化的配方,，非特異擴增比自配的試劑更低,。

4.高擴增效率，一般比 RT-PCR 靈敏一個數(shù)量級。

5.65℃左右同時完成逆轉(zhuǎn)錄和等溫擴增,，一步式操作,。

6.本試劑盒足夠 50 次 20 ?L 體系的實時熒光 RT-LAMP 擴增。

7.提供擴增對照,，便于在遇到困難時分析原因,。

8.20 ?L 體系最多可以使用 13 ?L 樣本，減少漏檢,。

9.UNG RT-LAMP MasterMix（熒光染料法）只能用于科研,，不能用于臨床。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成份規(guī)格包裝

UNG RT-LAMP MasterMix

（熒光染料法,，待加酶）200 ?L0.5 mL 黃蓋管

逆轉(zhuǎn)錄酶-擴增酶混合液100 ?L0.5 mL 紅蓋管

LAMP陽性對照模板-引物混合物

22040250 ?L0.5 mL 藍蓋管

超純水,，PCR 級1 mL1.5 mL 本色蓋

石蠟油，PCR 級1.5 mL1.5 mL 本色蓋

使用手冊1 份無

保存和運輸

低溫運輸,，-20℃保存,，有效期一年,。

自備試劑

RNA 模板,、RT-LAMP 引物

使用方法：

1. 制備模板RNA：用于選用合適的方法制備模板RNA。如果有N個樣品,，最好設(shè)置N+2個樣品制備,，多出的兩個一個是樣品制備陽性對照，一個是樣品制備陰性對照,。

2.配制20×RT-LAMP引物混合液,。

先加超純水將合成的HPLC級別的下列引物干粉稀釋到下表所標注的母液濃度，然后在一新的離心管中按表中所列體積加入各種引物母液和超純水,，

最后得到0.1 mL的20×RT-LAMP引物混合液,，此混合液足夠100次20 ?L體系的RT-LAMP擴增。如果需要配制的20×RT-LAMP引物混合液體積異于0.1 mL,，則各成分的用量請按比例調(diào)整,。引物混合液可以在-20℃放置2 年。

注：如果沒有Loop引物,，則用水替代,。

3.在冰上融化RT-LAMP MasterMix（熒光染料法，待加酶）,，混勻,，稍離心。第一次使用時,，請將100 ?L逆轉(zhuǎn)錄酶-擴增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix中并輕柔顛倒混勻1分鐘,，然后再使用。如果有N個樣品,，則在

N+2個反應管中加入以下組份,， 多出的一管是RT-LAMP擴增陽性對照

（PC）,，一管是RT-LAMP擴增陰性對照（NC）：

成份N+2 個樣品管RT-LAMP

擴增 PCRT-LAMP

擴增 NC

UNG RT-LAMP MasterMix

（熒光染料法，加酶后）6 ?L6 ?L6 ?L

自備 20×RT-LAMP

引物混合液1 ?L不加1 ?L

陽性對照模板-引物混合物不加4 ?L不加

自備 RNA 模板1-13 ?L不加不加

補自備超純水到20 ?L20 ?L20 ?L

4.混勻,，放熒光定量PCR儀器上65℃保溫90分鐘,，每分鐘采集一次SYBR通道的熒光信號。

5.反應結(jié)束后,，按下面的步驟處理和分析數(shù)據(jù),。

6.閾值的設(shè)定：LAMP 的閾值跟 LAMP 引物的專一性密切相關(guān)，因此新設(shè)計的引物需要先在不加模板的情況下進行 LAMP 擴增,，測定其 Ct,。Ct 最好沒有，如果有也最好不要低于 60（每分鐘采集一次熒光信號的話）,。如果低于 60,，則最好重新設(shè)計引物。

7.實驗有效性的判斷：如果閾值設(shè)定為 60,，則樣品制備陽性對照和擴增陽性對照的 Ct 應該在 60 以內(nèi),，樣品制備陰性對照、無模板陰性對照和無引物無模板陰性對照的 Ct 應該大于 60,，否則提取實驗或擴增實驗無效,。對無效的實驗不需要分析樣品的結(jié)果，需要尋找原因或跟廠家聯(lián)系,。

8.如果實驗有效,，則可以分析樣品的數(shù)據(jù)。樣品 Ct 小于閾值則判讀為陽性,，大于閾值則判讀為陰性,。

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