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產(chǎn)品簡介：

本試劑盒是結(jié)合植物葉綠體純化試劑盒和細(xì)菌蛋白質(zhì)提取試劑盒而推出的新興產(chǎn)品,，  專門用于植物葉綠體蛋白的快速提取,。

產(chǎn)品特點：

1.即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液,。

2.本產(chǎn)品足夠 15 次提取,，每次可處理 30g 葉片。

3.得到的提取物可以直接用于 SDS-PAGE,、2D 電泳,、免疫印跡分析、蛋白活性測定和BCA 法及 Lowry 法蛋白定量（不適用于 Bradford 法）,。

4.已經(jīng)成功用于菠菜,、大豆、萵筍,、白菜,、煙草和甜菜等植物，還可用于更多植物（可  能需要優(yōu)化條件）,。

5.植物葉綠體總蛋白純化試劑盒足夠 15 次葉綠體總蛋白純化,。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成份編號規(guī)格包裝材料

植物葉綠體純化勻漿液成分一250 mL×2250 mL 本色瓶

植物葉綠體純化勻漿液成分二

（干粉）3 g10mL 本色瓶

帶柄尼龍濾膜1 個塑料袋

Percoll60 mL60 mL 本色瓶

植物葉綠體蛋白提取溶液 A15 mL15 mL 本色瓶

植物葉綠體蛋白提取溶液 B1.5 mL1.5mL 本色管

使用手冊1 份無

保存和運輸

常溫運輸和保存, 但植物葉綠體蛋白提取溶液A 和植物葉綠體蛋白提取溶液B 需要-20℃ 保存。保存期限一年,。植物葉綠體純化勻漿液成分二（干粉）需要 4℃保存,。

自備試劑

去離子水

使用方法：

注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行,，所用器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷,。離心時一定要在 4℃進(jìn)行，離心力以 g 而不是 rpm 計算,。如果需要研究葉綠體的功能,，提取還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

一：葉綠體的純化

1.實驗前 1-2 天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成,，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂,。葉片在實驗前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗,，去掉多余水分,。如果葉片采集后不能立即處理,，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此,，  葉片的放置時間也不能超過一天,。

2.新鮮（實驗當(dāng)天）制備勻漿液：將自備的去離子水與植物葉綠體純化勻漿液成分一按

4：1 的比例混合，然后在混合液中加入植物葉綠體純化勻漿液成分二干粉到終濃度

0.1%（每 100 mL 中加入 0.1g 干粉）,，搖晃溶解后所得溶液即為葉綠體制備勻漿液,，冰上預(yù)冷待用。一次實驗（從 30 g 葉片提取葉綠體）所需要的勻漿液體積跟材料不同而不同,，可能需要摸索,。

3.新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈并將葉片剪成 1-3 cm2 大小的碎片并浸泡在適量的預(yù)冷的葉綠體制備勻漿液中（每克葉片加 4 mL 葉綠體制備勻漿液,，但對煙草和大豆,， 每克葉片需要加 6 mL 葉綠體制備勻漿液）。

4.將浸泡了葉片的葉綠體制備勻漿液轉(zhuǎn)移到Waring 勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)）中,，低速勻漿 10 秒,，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后,，再低速勻漿 10 秒,。注意：除 Waring 勻漿機(jī)外，還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器,，Polytron勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等裂解細(xì)胞的方法,，但這些方法的單次處理量都比較小， 需分成很多小份單獨勻漿,，然后再匯集,。

5.用帶柄尼龍濾膜過濾葉綠體制備勻漿液，可先將濾液收集到預(yù)冷的 200 mL 量筒中,， 再等分到 4 個預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過 35 mL）,。帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。

6.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對菠菜,，白菜和萵筍材料）或 400 g 離心 1 分鐘（對甜菜材料）,，白色沉淀為未破裂的細(xì)胞或細(xì)胞核。

7.將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個新的,、預(yù)冷的 50 mL 塑料離心管中。塑料離心管需要提前稱重,，以便最后計算制備所得的葉綠體濕重,。

8.在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清,，沉淀呈淺綠色,，此即為粗提葉綠體。再次稱重，計算出粗提葉綠體濕重,?？梢灾苯佑糜诟鞣N后續(xù)實驗。

9.如果需要精提葉綠體,，則在粗提葉綠體沉淀中加入 1.5 mL 預(yù)冷的葉綠體制備勻漿液,， 手彈離心管底部使葉綠體重懸。注意：重懸時最好避免溶液起泡,，也不要用槍頭吹打,，  否則吹打的拉力容易使葉綠體破裂。沉淀底部有白色淀粉屬于正?，F(xiàn)象,，但重懸葉綠體時應(yīng)避免將白色淀粉重懸。將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL）,，得到葉綠體粗提液,，用密度梯度離心法離心葉綠體粗提液，將其中的完整葉綠體和其中的其他污染物進(jìn)一步分離,。根據(jù)植物的不同,，可選用下述兩種密度梯度離心法之一進(jìn)行分離。

10.單密度梯度分離法（適合菠菜,，白菜和萵筍等材料）：

a)在 50 mL 塑料離心管中先加入 6 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 4 mL Percoll,，充分混合均勻。

b)在其液面上小心鋪上第 10 步匯集得到的約 6 mL 葉綠體重懸液,。

c)在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700g 離心 6 分鐘,，最上層的綠色帶含破碎的葉綠體， 線粒體和核糖體等,，管底的綠色沉淀為完整的葉綠體,。

d)小心將上清倒出后，在葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液成分一（不是植物葉綠體純化勻漿液）,，手指輕彈管底使之重懸,。

e)將葉綠體重懸液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中并避光保存?？稍谙嗖铒@微鏡下檢查葉綠體完整性,。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性,。

11.雙密度梯度分離法（適合煙草,，甜菜和大豆等材料）：

a)在 14 mL 塑料離心管中先加入 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 2 mL Percoll，充分混合均勻,，得密度梯度重液,。

b)在另一試管中將 3 mL 植物葉綠體純化勻漿液和 2 mL Percoll 充分混合均勻,，得密度梯度輕液。

c)將密度梯度輕液小心鋪在密度梯度重液之上,，然后將第 10 步匯集得到的葉綠體重懸液中的 4 mL(還剩下 2 mL)小心鋪在密度梯度輕液之上,。

d)在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 3200 g 離心 15 分鐘，最上層綠色帶含破碎的葉綠體,、線粒體和核糖體等,，重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體。

e)用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（葉綠體）轉(zhuǎn)移到新的離心管中,，加入三倍體積的預(yù)冷的植物葉綠體純化勻漿液成分一（非植物葉綠體純化勻漿液）,，   輕柔混勻。

f)在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700 g 離心 1 分鐘,，小心將上清倒出后,，在綠色的葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的 0.5 mL 植物葉綠體純化勻漿液成分一（非植物葉綠體純化勻漿液），手指輕彈管底使之葉綠體重懸,。

g)將葉綠體重懸液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 離心管中并避光保存,，也可在相差顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用,，否則非常容易失去活性,。

12.所得精提葉綠體可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化,，跨膜轉(zhuǎn)運,，體外葉綠體蛋  白合成，蛋白定位等研究,。還可用于的葉綠體膜,，基質(zhì)，類囊體,，葉綠體 DNA,、葉綠體 RNA 和總蛋白純化。

二：葉綠體總蛋

白質(zhì)的提取

13.按 15 mg 葉綠體濕重加 1 mL 植物葉綠體蛋白提取溶液 A 和 100 uL 植物葉綠體蛋白提取溶液 B 的比例將這兩種溶液加入到粗提葉綠體沉淀（第 8 步）或精提葉綠體沉淀（第 10 步或第 11 步）中,，吹打混勻,。

14.冰上放置 30 分鐘至 1 小時至溶液變清（葉綠體裂解）。

15. 4℃ 1,2000 g 離心 1 分鐘,。

16. 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的1.5 mL 塑料離心管中即得到葉綠體總蛋白溶液,，可置于-70℃ 冰箱保存或立即使用。如果要進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳,，可取部分樣品到離心管中,，加入 5×SDS-PAGE 上樣緩沖液或 2×SDS-PAGE 上樣緩沖液使其終濃度為 1×，在沸水中處理 5 分鐘后立即上樣電泳,。

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