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產(chǎn)品簡介：

易錯 RCA（Error-Prone Rolling Circle Amplification）是利用 phi29 DNA多聚酶在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、不同的 Mg 濃度和 MnCl2 存在時）能夠按較高的機率引入隨機引入突變,。易錯 RCA 彌補了易錯 PCR 的巨大缺陷,，其中一個缺陷是易錯PCR 沒法使用短的 DNA 片段,，因為PCR 引物就占了 40 個 bp 左右， 故不適合小片段 DNA 突變,。但任何短鏈 DNA 經(jīng)過環(huán)化后,，均可進行易錯 RCA，故易錯 RCA 可以對短的DNA 片段進行突變,。單鏈 DNA 模板易錯 RCA 示意圖如下：

產(chǎn)品特點：

1.即開即用,，十分簡單方便，用戶不需要辛苦摸索條件,。

2.配方經(jīng)過精心優(yōu)化,，突變率穩(wěn)定，一般能產(chǎn)生 3-5 個突變/kb,。如果需要更高的突變率,，只需把上一次易錯 RCA 的產(chǎn)物用作下一次易錯 RCA 的模板即可。也可以選購本公司的 Bst 法易錯 RCA 試劑盒,。

3.靶分子 DNA 既可以是長度只有幾十 bp 的小片段 DNA,，如啟動子，適配子,，酶活性區(qū),，核糖體結(jié)合區(qū)等，也可以是質(zhì)粒,，BAC,，YAC 或全基因組,。只是短的DNA 需要預(yù)先環(huán)化。

4.本試劑盒不含突變短的 DNA 所需要的環(huán)化試劑,。

5.試劑含有熒光染料,，可以實時檢測反應(yīng)情況，隨時終止,。也避免電泳,，節(jié)約珍貴的擴增產(chǎn)物。

6.RCA 屬于恒溫擴增,，只需要水浴或金屬浴,，不需要貴重的 PCR 儀器。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20uL 體系的易錯 RCA 反應(yīng),。

8.易錯滾環(huán)擴增試劑盒（phi29 法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

低溫運輸,，-20℃保存,有效期為一年,。

自備試劑

環(huán)狀 DNA 模板、超純水,。

使用方法：

1.首-次使用本試劑盒時,，需要在裝易錯 RCA 引物干粉的黃蓋管中加入 55uL 的自備超純水，吹打混勻后短暫離心,，放冰上待用,。沒有用完的引物需要放-20℃保存。

2.設(shè)置 20uL 體系的易錯 RCA 反應(yīng),。以下以一個樣為例,，每個樣本最好設(shè)置兩個濃度，每次實驗設(shè)置一個無模板陰性對照：

成分濃 度 1 濃 度 2 陰 性 對 照

4×易錯PCR 預(yù)混液5 uL5 uL5 uL

易錯 RCA 引物1 uL1 uL1 uL 易錯 RCA 專用 MnCl21 uL1 uL1 uL 環(huán)狀 DNA 模板1ng50ng不加

補自備超純水到19 uL19 uL19 uL

3.95℃2 分鐘后,，放室溫自然冷卻,。

4.每管中加入 0.5uL 易錯 RCA 專用 DNA 聚合酶。

5.30℃保溫 24 小時,，每 10 分鐘設(shè)置為一個循環(huán),，在 SYBR 通道采集熒光信號。

6.實時檢查易錯 RCA 熒光信號,，在兩種情況下可以立即終止實驗,，不一定要等 24 小時結(jié)束。一是兩個濃度模板中任何一個的熒光信號進入 S 型平臺期,，二是無模板陰性對照的熒光信號正好要爬升而樣品的熒光信號已經(jīng)爬升,，此時可終止實驗，將樣本的擴增產(chǎn)物進行后續(xù)處理,。

7.擴增結(jié)束后,，對有擴增信號的樣品，按常規(guī)操作進行 DNA 回收，再限制性內(nèi)切

酶酶切驗證,。如果得到預(yù)期大小的片段,，則膠回收 DNA，再進行克隆和測序等后續(xù)操作,。

8.易錯 RCA 的擴增產(chǎn)品可以用水稀釋 10 倍后,，再進行全基因組擴增，得到更多的DNA,，然后再進行酶切,，膠回收，克隆等后續(xù)操作,。

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