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產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是包涵體微量純化試劑盒的大提升級產(chǎn)品,，用于大量,，快速的提取高質(zhì)量的包涵體。

產(chǎn)品特點：

1.大量提取,，1 次可處理多達 5 升的菌液,，相當于 50 次中量提取。

2.適合制備級別的包涵體純化,，需在 50 mL 以上的離心管或離心瓶中完成,。

3.能有效去除包涵體中的細胞壁和細胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白在包涵體中所占比重達到 60%以上,。

4.本產(chǎn)品主要用于從大腸桿菌宿主中純化包涵體,，也能用于真菌和其他表達系統(tǒng)，  但純化條件（主要是細胞裂解條件需要自行優(yōu)化）,。

5.對大腸桿菌宿主,，本手冊提供高壓裂解和酶學裂解兩種破碎細菌，超聲打斷DNA 的實驗方案,。

6.得到的包涵體可以用于重折疊,，也可以用于凝膠層析和動物免疫。

7.本產(chǎn)品足夠 2 次純化,，每次可以處理 5 升菌液,。

8.大量包涵體純化試劑盒只可用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

常溫運輸和保存（溶菌-酶需要-20℃保存,，包涵體溶解液可以室溫保存），有效期一年,。

自備試劑

如果得到的重組蛋白確有降解則需要自備蛋白酶抑制劑混合物,。

使用方法：

一、細胞沉淀

1.轉(zhuǎn)移 1-5 升的菌液到干凈的,、預稱重量的塑料離心瓶中,。如果離心瓶體積不夠大，可以分多次反復離心收集,。

2.5,000 g（相當于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭 5500 rpm）4℃離心 15-30 分鐘,，小心棄上清。

3.復稱重量,，差值就是細菌的濕重,。1 升的過夜培養(yǎng)的大腸桿菌濕重一般為 3 克,， 所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克細菌,。注意：后續(xù)操作的很多溶液都是按此步得到得細胞濕重添加。

4.細胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用,。

二,、高壓破碎法（French Press）+超聲法裂解細菌（推薦方法）

1.按每克細菌濕重加入 3 mL 包涵體純化溶液 A 重懸細胞,，1-5L 的菌液得到的細菌沉淀一般是 3-15g，故需要加入 9-45mL 包涵體純化溶液 A,。加入后可以用玻璃棒攪拌或用 Waring 搗碎機勻漿（如果細菌濕重超過 10 克）使細菌懸浮,，直到檢測不到成塊的細胞為止。

2.留少量樣品做未裂解對照,，剩余得樣品通過壓力為 16000-18000 lb/in2 的高壓細胞破碎儀裂解,，收集的細胞裂解液需放冰上，顯微鏡下檢查裂解前和裂解  后完整細菌得數(shù)量,，反推出裂解細菌的比例,。

3.重復上步操作一次或多次，直到在顯微鏡下觀察不到或只能觀察到非常少的完  整細菌,。

4.一般經(jīng)過多次高壓細胞破碎的裂解液不會非常粘稠（DNA 被打斷）,。如果還是非常粘稠，將細胞裂解液置于冰浴中,，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理打斷DNA,，工作狀態(tài)為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）,，直到不再粘稠為止,。此進行此操作時，最好將細胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌,，否則產(chǎn)生的熱量會  使包涵體蛋白變性,，在純化中丟失。

三,、酶法+超聲法（在沒有高壓破碎儀器時的候選方法）

5.按每克細菌濕重加入 3 mL 包涵體純化溶液 A 重懸細胞,，1-5L 的菌液得到的細菌沉淀一般是 3-15g，故需要加入 9-45mL 包涵體純化溶液 A,。加入后可以用玻璃棒攪拌或用 Waring 搗碎機勻漿（如果細菌濕重超過 10 克）使細菌懸浮,，直到檢測不到成塊的細胞為止。

6.在細菌懸浮液中加入溶菌-酶干粉,，使其終濃度為120mg/mL（45mL 加5.4g）,，攪拌混勻后 37℃放置 30 分鐘裂解細菌，其間不時需要用玻璃棒混勻,。細菌釋放出的 DNA 將使裂解物變得十分粘稠,。如果不粘稠，說明裂解不充分,，需要繼續(xù)裂解,，否則完整細菌將和包涵體一起沉淀，影響包涵體的純度,。最好在顯微鏡下檢查細菌是否充分裂解,。

7.將細胞裂解液置于冰浴中,，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理打斷 DNA，工作狀態(tài)為 50%（開 0.5 秒,，關(guān) 0.5 秒）,，一般需要 5 分鐘。具體可以根據(jù)溶液粘稠度決定,。此進行此操作時,，最好將細胞裂解液放冰上并用磁力攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會使包涵體蛋白變性,，在純化中丟失,。

四、包涵體純化

8.將超聲處理后的細胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心瓶中,，7000g 4℃下高速離心 60 分鐘

（注意：轉(zhuǎn)子不同 7000g 對應的離心速度不同）,，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重組蛋白,，可以保留作為 SDS-PAGE 對照樣品,。

9.將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在預冷的包涵體純化溶液 B 中。每克細菌需要 5 mL 包涵體純化溶液溶液 B,，1 升細菌的濕重約 3 克,，大約需要 15 mL， 用玻璃棒或勻漿器攪拌混勻后室溫放置 5 分鐘,。

10.7000g 4℃下高速離心 30 分鐘,，沉淀將出現(xiàn)三層，最下面的是未徹-底破裂的細胞碎片,，其上是包涵體,，最上層的松軟沉淀是細胞壁和細胞外膜。如果處理  過程中使用過溶菌-酶,，則此層較薄,。小心收集上清，可以作為包涵體第一次洗  滌的對照樣品,。

11.重復第 9-10 步直到上清變清和最上層細胞壁和細胞外膜松軟沉淀消失,，此過程一般需要重復洗滌 2 次（共 3 次洗滌），小心收集上清作為包涵體第二次洗滌和第三次洗滌的對照樣品,。本試劑盒提供的包涵體純化溶液 B 足夠一次 5 升規(guī)模的提取洗 3 次,，如需更多包涵體純化溶液 B 請單獨購買。

12.上步得到的沉淀即為包涵體,，其中重組蛋白一般占 60%重量,，其余 40%為其他蛋白質(zhì)。此沉淀可以長期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫動物制備抗體,，還可以直接進入下面得包涵體的溶解步驟。

13.估計重組蛋白的產(chǎn)率：首先需要通過預實驗知道重組蛋白的表達水平,，如果表  達水平為 1%,，則 1 克濕重的細菌中將含有 1 mg 重組蛋白質(zhì)。此法得到的重組蛋白質(zhì)的回收率一般在 75%,，即 1mg 重組蛋白質(zhì)能得到 0.75 mg,，丟失0.25mg。

五,、包涵體的溶解

14.在室溫下,，將包涵體溶解液加入到包涵體沉淀中，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩,。  如果需要將溶解的包涵體直接用于凝膠過濾層析進一步純化,，則按每克原始細胞濕重加入 1 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 4-5 mg/mL,；如果需要將溶解的包涵體直接用于蛋白質(zhì)折疊,，則按每克原始細胞濕重加入 3 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 1-2 mg/mL,；注意：包涵體溶解液低溫放置會產(chǎn)生沉淀,，必須 45-65℃溶化并混勻后才能使用。注意：包涵體溶解液含6M 鹽酸胍,，溶解蛋白能力強于含 8M 尿素的溶解液,，但 SDS-PAGE 時不能直接上樣?？蛻艨捎米詡涞哪蛩嘏渲?8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不穩(wěn)定,， 所以不能長期放置）溶解包涵體，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 或后續(xù)純化,。但其溶解能力弱于鹽酸胍,。

15.室溫放置 1 小時使蛋白質(zhì)充分溶解。

16.7000g 4℃離心 60 分鐘(轉(zhuǎn)速需要根據(jù)離心機轉(zhuǎn)子的大小換算),，小心收集上清,，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力,。含溶解蛋白的上清脫鹽后,，可以進行 SDS-PAGE 電泳，檢查是否大部分重組蛋白都在上清中,。如果沒有,，說明包涵體沒有完-全溶解，需要用適當增加包涵體溶解液的用量。

17.將上清（溶解的包涵體）分成 10-20mL 一份,，放于塑料離心管中（不要超過離心管容量的 70%）置-80℃長期保存或直接用于復性等試驗,。由于不同的蛋白質(zhì)有不同的優(yōu)良復性條件，需要用戶自己摸索,。包涵體純化過程中引入了溶

菌-酶,，在 SDS-PAGE 分析時可能有額外條帶出現(xiàn)。

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