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產(chǎn)品簡介：

DNA 甲基化分析中的關(guān)鍵步驟是亞硫酸氫鹽修飾 DNA,，此反應(yīng)要求 DNA 必須處于單鏈狀態(tài),，反應(yīng)還必須在低溫進行,。由于常規(guī)的修飾反應(yīng)都在液相進行，在低溫下讓液相中的 DNA 保持單鏈狀態(tài)非常棘手,，故修飾效率很低,。此外，修飾反應(yīng)要多次切換反應(yīng)液,， 有多個沉淀步驟,，故 DNA 回收率一般都不高于 50%。為克服這些缺點,，本公司開發(fā)出了此產(chǎn)品,。

產(chǎn)品特點：

1.用包埋的 DNA 進行所有操作，免去所有沉淀和純化步驟,，極大簡化了操作,。

2.免去了 DNA 提取過程,，所需實驗材料更少，最少幾個細胞都可以,，極大地節(jié)約了寶貴材料,，尤其適用于珍-稀材料。

3.包埋中的 DNA 在整個操作過程中都處于單鏈狀態(tài),，提高了修飾效率,。

4.DNA 包埋在包埋塊中，切換反應(yīng)液不但非常方便,，而且 DNA 回收率都在 90%以上,。

5.既適用于實體材料和懸浮細胞，也適用于純化好的 DNA 樣品,。

6.DNA 甲基化修飾試劑盒（凝膠法）足夠制備 150 多個 10uL 包埋塊（如果用純化好的 DNA）或 25 個 10uL 包埋塊（如果用懸浮細胞）,。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

常溫運輸及保存。蛋白酶 K 溶液（10mg/mL）,、包埋液,、包埋塊裂解液需低溫運輸，

-20℃保存,。有效期一年,。

自備試劑

超純水

使用方法：

一、準備試劑

1.在裝有 2.3g 天凈沙甲基化修飾溶液B 成分一干粉的棕色瓶中加入 3.9 mL 水和 0.9 mL 天凈沙甲基化修飾溶液 A,，搖晃溶解得到 4.8 mL 溶液 B 成分一,。

2.在裝有 110mg 溶液 B 成分二干粉的離心管中加入 1 mL 50℃預熱的超純水，搖晃溶解,，得到溶液 B 成分二,。

3.將 0.6 mL 溶液 B 成分二加入到 4.8 mL 溶液 B 成分一中，得到 5.4 mL 溶液 B 工作液,，冰上放置待用,。未用完的溶液 B 工作液不得再使用。

4.每次實驗前,，將裝有 1.5 mL 包埋液的離心管在沸水浴上放置數(shù)分鐘直到變成溶液,， 然后放 80℃待用。

二,、對微量組織材料（如果材料足夠,，可先純化 DNA，再直接進入第三步）

5.用常規(guī)的胰-酶消化法處理動物實體組織或培養(yǎng)細胞,，得到濃度不超過 60 個細胞/uL 的單細胞 PBS 懸液,。如果實驗材料已經(jīng)是單細胞懸浮液（如卵細胞）,，則 PBS 洗滌后直接離心沉淀，再重懸在 PBS 中（濃度不超過 60 個細胞/uL）,。注：本試劑盒不含本步所需相關(guān)試劑,，如胰-酶消化液和 PBS。

6.在一個自備的 2 mL 離心管中加入 3 uL 上步所得細胞懸液,，再迅速滴加 7 uL 在80℃預熱的包埋液,，共得 10uL 包埋液-細胞混合液。注：不需要吹打混勻以免混合液在搶頭里面凝固,。

7.加入 500 uL 分子生物學級石蠟油確保后續(xù)處理過程中溶液不會蒸發(fā),。短暫離心確保10uL 包埋液-細胞混合液沉到管底。

8.將離心管在沸冰浴中放 20 分,，此步可將 DNA 分子變性成單鏈,。

9.將離心管轉(zhuǎn)移到冰上放置 30 分鐘，包埋液-細胞混合液將凝固成 10uL 的包埋塊,， 包埋塊中將包含細胞的基因組 DNA 和蛋白質(zhì)組份。

10.在包埋塊中加入 500 uL 包埋塊裂解液和 5 uL 蛋白酶 K 溶液（10mg/mL）,，短暫離心后 37℃保溫過夜,。此步將降解包埋塊中的蛋白質(zhì)組份。

11.吸棄包埋塊之外的所有溶液（包括石蠟油）后,，分別用 1mL TE 緩沖液室溫浸泡包埋塊 2 次,，每次 15 分鐘。此步可去除殘留在包埋塊中的裂解液和蛋白酶 K,。

12.酶切包埋塊中的基因組 DNA：選定不識別 PCR 靶片段的內(nèi)切酶（本試劑不提供該試劑）,，再用此酶對應(yīng)的 100 uL 1×酶切緩沖室溫液浸泡包埋塊 15 分鐘，吸棄該緩沖液后再加入 100 uL1×酶切緩沖和 50U 選的的內(nèi)切酶,，37℃保溫 2 小時后吸棄內(nèi)切酶反應(yīng)液,。

13.加入 500uL 新鮮配制的處理液 A，室溫放置 15 分鐘后吸棄處理液 A,。處理液 A 配制方法：100 uL DNA 甲基化修飾溶液 A +400 uL 超純水,。

14.重復上步一次。此時 DNA 將呈單鏈,。

15.加入 1 mL 新鮮配制的處理液 B（不是溶液 B）,，室溫浸泡包埋塊 5 分鐘后吸棄處理液 B。處理液 B 配制方法：50uL DNA 甲基化修飾溶液 A +950 uL 超純水,。

16.加入 750uL 石蠟油,，然后沸水浴 30 秒，使 DNA 變性,。

17.將離心管轉(zhuǎn)移到冰上放置 30 分鐘使包埋塊重新凝固,，單鏈 DNA 將固化,。

18.在離心管中加入 1mL 在第 3 步預冷的溶液 B 工作液，短暫離心后繼續(xù)在冰上放置30 分鐘,。此步用于修飾固化的單鏈 DNA,。

19.將離心管轉(zhuǎn)移到 50℃放置 3.5 小時后吸棄溶液 B 工作液。

20.分別用 1mL TE 緩沖液常溫洗滌包埋塊 2 次,，每次 15 分鐘,，吸棄 TE 緩沖液。

21.分別用 500 uL 新鮮配制的處理液 C（50 uL DNA 甲基化修飾溶液 A +450 uL 超純水）常溫洗滌包埋塊 2 次,，每次 15 分鐘,，然后吸棄處理液 C。

22.用 1 mL TE 緩沖液常溫洗滌包埋塊 3 次,，每次 10 分鐘,，然后吸棄 TE 緩沖液。

23.所得包埋塊可以在 4℃保存數(shù)月待用,，也可以用超純水洗滌兩次（每次 15 分鐘）后直接用做 100uL 體系甲基化 PCR 的模板,。

三、對純化好的DNA 溶液

24.如果樣本是純化好的 DNA 溶液,，先用不識別 PCR 靶片段的合適內(nèi)切酶酶切 DNA,， 總體積不超過 20uL，DNA 不超過 700 ng,。本試劑盒不提供所需內(nèi)切酶,。

25.酶切結(jié)束后，沸水浴 10 分鐘滅活內(nèi)切酶并變性 DNA,。

26.冰上放置并短暫離心數(shù)秒后,，再加入 4 uL DNA 甲基化修飾溶液 A，50℃保溫 15 分鐘,。

27.迅速加入 50 uL 在 80℃預熱的包埋液,，用手指快速彈擊管底混勻溶液并繼續(xù)放 80℃ 待用。不要吹打混勻以避免包埋液在移液槍頭中凝固,。

28.在一個新的 2 mL 離心管中,，加入1 mL 第 3 步預冷的溶液B 工作液，再加上 750 uL 石蠟油,，短暫離心后將離心管放冰上預冷,。

29.迅速取 80℃保溫的混合液 10uL（第 27 步），用在空中滴加的方式加到第 28 步準備的預冷離心管中,，滴加的混合液遇冷將迅速在石蠟油中形成一個包埋塊,。注意：  不要將槍頭浸入到預冷的溶液中，否則包埋液將迅速在槍頭內(nèi)凝固,。如果包埋塊沒  有沉到管底,，可以用槍頭將其撥到石蠟層下面的液相中,。

30.再重復上步操作 6 次，共可以得到 7 個包埋塊（每塊約含 100ng DNA）,。

31.將離心管（含 7 個包埋塊）繼續(xù)放冰上 30 分鐘進行修飾,。

32.后續(xù)操作同第 19-23 步。

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