目錄:上海烜雅生物科技有限公司>>分子生物學試劑>>試劑盒>> 逆轉錄酶活性檢測試劑盒（PERT 法）
| 供貨周期 | 現貨 | 規(guī)格 | 50次 |
|---|---|---|---|
| 貨號 | XY-D-1612 | 應用領域 | 化工,生物產業(yè) |
| 主要用途 | 科研 | 英文名稱 | Reverse Transcriptase Assay（PERT） |
| 保存條件 | -20℃ | 有效期 | 12個月 |
產品簡介：
WHO 規(guī)定生物制品中不能含有逆轉錄病毒污染，逆轉錄病毒種類繁多,，故一般通過 檢測逆轉錄酶活性來間接檢測逆轉錄病毒存在與否,。藥典規(guī)定的檢測逆轉錄酶的方法是PERT 法（Product-Enhanced Reverse Transcription），其原理是用待測樣品代替逆轉錄酶進行 RT-PCR,，通過標準品制備的標準曲線計算出樣品中是否存在逆轉錄酶以及其濃度,，進而推算出樣本是否含有逆轉錄病毒及其濃度。PERT 法根據酶活性檢測,，普適性廣,，可檢測出 oncovirus、lentivirus 和 spumavirus 等幾大類已知和未知的逆轉錄病毒,。但常規(guī) PERT 法是兩步法 RT-PCR 加電泳檢測,，操作繁瑣，誤差大,，不適合高通量操作,。為克服此缺點,，本公司開發(fā)了一管式實時PERT 試劑盒,。
產品特點：
1.即開即用，用戶只需要提供待測樣品,。
2.操作簡單快捷,，一步加樣操作，變異系數小,，適合高通量操作,。
3.實時熒光檢測，一管式反應,，避免樣本交差污染,。
4.靈敏性高，最-低可以檢測到幾十個逆轉錄酶分子的活性,。
5.背景低,，本產品所用的 DNA 聚合酶不含背景逆轉錄酶活性，使用的 RNA 模板在生命周期中無 DNA 環(huán)節(jié),，不會自帶污染源,。
6.起始樣本可以是細胞培養(yǎng)上清液,、細胞裂解液和純化的逆轉錄酶溶液，可以檢測到里面所含有的逆轉錄酶活性,，并由此判斷是否有逆轉錄病毒的存在,。
7.含逆轉錄酶陽性對照，便于制備標準曲線和排除假陰性實驗,。
8.定量檢測的線性范圍至少為 6 個數量級,。
9.本產品足夠 50 次 20 μL 體系的 PERT 反應。
10.逆轉錄酶活性檢測試劑盒（PERT 法）只能用于科研,，包括生物制品和細胞庫等質檢環(huán)節(jié),。
產品參數：
產品規(guī)格
成分編號規(guī)格包裝
PERT 樣品稀釋液12 mL15 mL 本色瓶
MMLV 逆轉錄酶，200 U/μL
比活：見標簽20 μL0.5 mL 紅蓋管
PERT 引物-探針干粉50 次0.5 mL 棕塑管
PERT RNA 模板干粉50 次0.5 mL 白蓋管
2×PERT MasterMix500 μL0.5 mL 綠蓋管
使用手冊1 份無
保存和運輸
低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為 12 個月。
自備試劑
樣品,、超純水,、蛋白濃度測定試劑盒。
使用方法：
一,、在生物安全柜中準備用于PERT 的樣品
1.細胞培養(yǎng)上清液制備：收集上清液,，11,000×g 離心 10 分鐘，0.45 μm 濾膜過濾,， 100,000×g 超速離心 60 分鐘得病毒顆粒,。用PERT 樣本-稀釋液重懸病毒顆粒后放冰上待用，此為待測樣本,。每次PERT 實驗可以用 1-5 μL 待測樣本,。
2.細胞裂解液制備：將洗滌后的 1E6 個細胞沉淀重懸在 200 μL PERT 樣本-稀釋液中，冰上放置 20 分鐘裂解細胞,。用自備的試劑測定蛋白濃度,，每次 PERT 實驗需要用0.1-1 μg 蛋白樣本。
二,、制備 MMLV 逆轉錄酶的梯度稀釋液（以 10 個 10 倍稀釋度為例）,。
3.標記 10 個離心管，分別為 1,、2,、3、……8,、9,、10。
4.用帶芯槍頭在 10 個管中分別加入 45 μL PERT 樣本-稀釋液。
5.在 1 號管中加入 5 μL MMLV 逆轉錄酶（200 U/μL,，試劑盒提供）,，輕柔吹打 1 分鐘得 1 號稀釋液，放冰上待用,。此為原液的 1E1 倍稀釋液,，濃度為 20 U/μL。
6.換槍頭,，在 2 號管中加入 5 μL 1 號稀釋液,，輕柔吹打 1 分鐘得 2 號稀釋液。放冰上待用,。此為原液的 1E2 倍稀釋液,，2 U/μL。
7.重復上面的操作直到得到 10 個稀釋度的標準曲線樣品,，放冰上待用,。一般第一次實驗時先選用 3-8 號稀釋液共 6 個樣本，然后根據結果再決定后續(xù)實驗是用更低還是更高稀釋度的樣本,。上述稀釋的酶標準品在-20℃至少可保存 3 個月,。
三、設置 PERT 反應
8.首-次使用本產品時,，請將PERT RNA 模板溶液管渦旋震蕩 30 秒混勻后放冰上待用,。沒用完的模板溶液需放-80℃保存。
9.如果有 N 個待測樣本,，做 6 個點的標準曲線,，則標記 N+7 個反應管，其中 N 個管用于 N 個待測樣本,，多出的 1 個管用于無樣本陰性對照,，6 個用于制作標準曲線（也相
當于陽性對照）。按下表加入各成分：
成分無模板對
照無樣本對照N 個樣品管6 個標曲管
PERT 引物-探針混合液3 μL3 μL各 3 μL各 3 μL
PERT RNA 模板溶液-2 μL各 2 μL各 2 μL
PERT 樣本-稀釋液2 μL2 μL--
超純水5 μL3 μL各 3 μL各 3 μL
N 個待測樣本--各 2 μL-
第 8 步所得 MMLV 標--各 2 μL
準品的 3-8 號稀釋液（需加入到所
對應的管中）
2×PERT MasterMix各 10 μL10 μL10 μL各 10 μL
注意：如果樣本含 DNA 聚合酶,，由于部分 DNA 聚合酶也有微弱的 RT 活性,，故無逆轉錄酶的樣本也可能出現陽性結果,。用戶可以在每管中加入 2 μL DNA 聚合酶 RT 活性抑制劑予以屏蔽（同時少加 2 μL 超純水）,。該產品需另購。
10. 在 PCR 儀上進行如下反應：42℃ 10 分鐘,，95℃ 5 分鐘,，（95℃15 秒、52℃ 30 秒,、72℃ 30 秒）循環(huán) 35 次循環(huán),。注意：42℃是本產品提供的 MMLV 逆轉錄酶標準品的最適溫度，用戶可根據待測逆轉錄酶的最適溫度調整。如需提高檢測極限,，可延長逆轉錄時間至 100 分鐘,，循環(huán)數可嘗試 45 循環(huán)。
五,、數據處理
11.實驗有效性判斷：如果無模板對照或無樣本對照出現了Ct 值并且熒光信號有標準的倒S 擴增曲線,，則說明試劑或環(huán)境有污染，則整個實驗無效,。如果所有陽性對照（標曲管）均無擴增,，則說明試劑、儀器或操作有問題,，則整個實驗也無效,。實驗無效時需要先找到原因后再繼續(xù)實驗。如果實驗有效,，可繼續(xù)后續(xù)的分析,。
12.制作標準曲線：以 MMLV 逆轉錄酶標準品的濃度（p U/μL，不是 U,，下同）的 log
值為橫軸,，以 FAM 通道的 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線,。
13.用 N 個待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出其對應逆轉錄酶濃度的 log 值,，再用該
log 值計算出其對應的逆轉錄酶濃度，再根據體積計算出使用的活力單位,。
14.如果知道所測逆轉錄酶的重量,，則可以計算出其比活（活性單位/mg）。本批次提供的 MMLV 逆轉錄酶的比活見標簽,。
15.如果知道所測逆轉錄酶的分子量,，還可以計算出每個逆轉錄酶分子有多少活性單位。假設測出某 AMV 逆轉錄酶樣本比活為 36500 U/mg,，由于 AMV 逆轉錄酶的分子量為 158 kDa,，則 1mg AMV 逆轉錄酶的摩爾數為 1/1.58E8，其對應的分子數為 6.02E23×（1/1.58E8）=3.81E15,。由于 1 mg 的活力為 35600 U
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