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產(chǎn)品簡介：

無縫克隆是一種簡單,、快速,、高效的 DNA 定向克隆技術(shù)，該技術(shù)突破傳統(tǒng),， 不依賴內(nèi)切酶和連接酶,，不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制，利用同源重組的原理,，可將任何 DNA 片段克隆至任何載體的任何位點,。反應(yīng)及轉(zhuǎn)化時間短，陽性率達(dá) 95%以上,。此反應(yīng)的示意圖如下：

產(chǎn)品特點：

1.簡單,、高效地定向克隆 DNA 片段。

2.可同時定向克隆兩個或多個 DNA 片段,。

3.不依賴內(nèi)切酶和連接酶,，不受限制性內(nèi)切酶酶切位點的限制。

4.省時,，反應(yīng)時間加轉(zhuǎn)化時間短至 20 分鐘,。

5.PCR 產(chǎn)物（僅有目的條帶、無非特異條帶和引物二聚體）可直接進(jìn)行重組反應(yīng),，無需純化,。

6.本產(chǎn)品足夠 20 次 20μL 體系的無縫克隆。

7.無縫克隆試劑盒只能用于科研,。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

低溫運輸,，-20℃保存，有效期一年,。

自備試劑

線性化載體,、DNA 片段、感受態(tài)細(xì)胞,、SOC 或 LB 培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿（含抗菌素和不含的）

使用方法：

一,、線性化載體的制備：

可通過單酶切、雙酶切或 PCR 擴增的方法來制備,。（如果線性化不徹-底,，將會導(dǎo)致陰性克隆的產(chǎn)生，推薦使用雙酶切或 PCR 擴增的方法,。）

二,、DNA 片段的制備：

1. DNA 片段可通過 PCR 擴增或酶切的方法制備，PCR 擴增片段無需純化即可用于重組反應(yīng),。

2.PCR 擴增法引物設(shè)計原則：引物的 3’端必須包含 18-50 個能與模板 DNA 結(jié)合的堿基序列,，以便 PCR 擴增出目的 DNA 片段。引物的 5’端必須包含15-80 個與線性化載體末端同源的堿基序列,，以便 PCR 擴增片段能與線性化載體進(jìn)行重組反應(yīng),。

三、重組反應(yīng)：

3.按照如下體系操作：

4.50℃反應(yīng) 20 分鐘,，然后將離心管放置于冰上 2 分鐘,。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗，請將連接產(chǎn)物放-20℃保存,。

四,、轉(zhuǎn)化：

5.取 4 μL 連接液至 50-100 μL 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻,，冰浴 30分鐘,。

6.42℃水浴熱激 90 秒。

7.立即放置于冰上靜置 5 分鐘,。

8.加入 500 μL 無菌 SOC 或 LB 培養(yǎng)基（不含抗生素）,，37℃，200-250 rpm振蕩培養(yǎng) 45-60 分鐘,。

9.吸取 200 μL 菌液涂板,，為得到更多克隆，可先 4000 rpm 離心 3 分鐘,，棄掉部分上清,，用移液器輕吹菌體,，至充分懸浮，取全部菌液涂板,，然后 37℃ 培養(yǎng)過夜（12-16 小時）,。

10.用菌落 PCR、直接測序或其他方法鑒定重組子,。

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