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產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是在 BCA 法蛋白定量試劑盒基礎(chǔ)上改進(jìn)的超敏蛋白定量試劑盒,，尤其適合對低濃度的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行定量分析,。其原理是蛋白質(zhì)分子在堿性條件下將二價 Cu 離子還原為一價 Cu 離子 (雙縮脈反應(yīng)) ,，一個一價 Cu 離子再與二個 BCA 分子鰲合產(chǎn)生一種在吸收波長為 562 nm 的紫色水溶性產(chǎn)物,，根據(jù)紫色水溶性產(chǎn)物的濃度反推出蛋白質(zhì)的濃度,。BCA 法原理示意圖如下：

產(chǎn)品特點：

1.超敏感,，最-低檢測濃度為 0.5 μg/mL。

2.線性范圍在 0.5～20 μg/mL,，尤其適用于低濃度的樣品,。

3.對大多數(shù)離子型和非離子型去污劑不敏感，但對 Cu 的還原劑和螯合劑敏感,。

4.比 Lowry 法更加簡單快捷,，45 分鐘內(nèi)完成測定。

5.試劑穩(wěn)定,，但工作液 1 天內(nèi)有效,。

6.終產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量,。

7.最短可以檢測雙肽,，所以適合于分子量較小的蛋白質(zhì)，而 Bradford 法需要一定大小的蛋白質(zhì),。

8.本產(chǎn)品不能用于測定含有DTT 等還原劑的蛋白溶液,。

9.蛋白濃度測定試劑盒（BCA 超敏法）只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

常溫運輸和保存,，但 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品需要低溫運輸,，-20℃保存，有效期一年,。

自備試劑

樣品緩沖液

使用方法：

1. 用合適的方法制備待測蛋白樣品，并把蛋白質(zhì)溶解在合適的樣品緩沖液中,。本檢測方法受待測樣品中螯合劑和還原劑的影響,，所以需確保待測蛋白溶液中 EDTA 的終濃度不高于 10 mM、二硫蘇糖醇不高于 1 mM,、β-巰基乙醇不高于 1 mM,，沒有任何 EGTA。如果達(dá)不達(dá)上述要求,，則需要稀釋樣品,，使其濃度降低到上述濃度之下。

2.將本試劑盒提供的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品（2 mg/mL）10 μL 和 490 μL 自備的樣品緩沖液（用于溶解待測樣品的溶液）混合,，得到 500 μL 濃度為 0.04 μg/μL 的 BSA工作液,，放冰上待用,，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。上述量足夠一次實驗使用,。此 BSA 工作液每次實驗均需要新鮮配制,。

3.配制超敏 BCA 工作液：先計算一次檢測所需 BSA 工作液的體積。如果有 N 個樣品,，每個樣品只做一次重復(fù),，再加上 7 個標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，一般多準(zhǔn)備 10%的量,， 故一次檢測所需 BSA 工作液的體積為：0.15 mL×（N+7）×110%,。配制時將超敏型 BCA 蛋白定量溶液A、超敏型 BCA 蛋白定量溶液B 和超敏型 BCA 蛋白定量溶液 C 按 50：48：2 的比例混合得到到所需體積即可,。如果需要 10 mL,，則三種溶液體積分別為 5 mL、4.8 mL,、0.2 mL,，所得溶液即超敏 BCA 工作液。

4.取一塊 96 孔板,，按下表加入上步新鮮制備的 BSA 工作液,、N 個待測蛋白樣品和自備樣品緩沖液：

5.在每個孔中（總體積為 150 μL）加入等體積的超敏 BCA 工作液并混勻。如果用排槍加入并混勻則更好,。也可把 96 孔板放在振蕩器上振蕩 30 秒混勻,。

6.60℃放置 1 小時。本試劑受溫度和時間影響較大,，故需要準(zhǔn)確定時和定溫,，以保證精確定量。

7.冷至室溫,，迅速在 562 nm 下比色測定所有樣品的光吸收,。如酶標(biāo)儀沒有 562 nm的設(shè)定，可用接近的波長檢測,，如 570 nm,。測定操作最好在 10 分鐘內(nèi)完成，否則化學(xué)反應(yīng)還在繼續(xù)進(jìn)行,，光吸收值每 10 分鐘會升高 2.5%左右,。

8.處理數(shù)據(jù)：將編號為 0 號的樣品（對照）的讀數(shù)從其余所有樣品（包括 0 號樣品， 其讀數(shù)變成零）中扣除,。

9.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 0-7 號樣品的 BSA 含量（單位μg,，見上表最右行）為橫坐標(biāo)，

0-7 號樣品吸光值（扣除背景讀數(shù)的）為縱坐標(biāo)，繪出BSA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

10.再將 N 個待測樣品的吸光值（減去 0 號樣品的讀數(shù)后）標(biāo)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上,，其在橫坐標(biāo)上對應(yīng)的蛋白含量（μg）就是待測樣品中的蛋白質(zhì)含量，除以樣品稀釋液總體積（20 μL）,，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實際濃度,，單位為 μg/μL。

二：注意事項

11.第 5 步加 BCA 工作液后也可以在室溫放置 2 小時,，或 60℃放置 30 分鐘,。超敏BCA 法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深,。并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快,。所以，如果蛋白質(zhì)濃度較低,，可以改在 60℃孵育 60 分鐘,。

12.待測樣品濃度在 20～2000 μg/mL 范圍時有較好的線性關(guān)系。

13.超敏 BCA 法測定蛋白濃度時,，不受下列化學(xué)物質(zhì)的影響：

名稱濃度小于下面數(shù)值時不受影響

Ammonium Sulfate1.5 M

Brij-355.0%

CHAPS5.0%

EDTA10 mM

Hepes100 mM

Glycine, pH 2.8100 mM

Guanidine HCl4.0 M

Tween 20,、60、805.0%

SDS5.0%

Sodium Acetate pH 5.5200 mM

Sodium Chloride (NaCl)1.0 M

Sucrose40%

Sodium Hydroxide (NaOH)0.1 M

NP-405.0%

Triton X-1005.0%

Urea3.0 M

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