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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化試劑盒是基于超速離心的快速提取細(xì)菌膜蛋白的試劑盒,。其原理是裂解細(xì)胞后,，通過(guò)超速離心分離出細(xì)菌細(xì)胞膜和附著的蛋白質(zhì),。跟傳統(tǒng)的密度梯度離心法和去污劑法相比,。

產(chǎn)品參數(shù)：

規(guī)格及成分

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存，但 DNase I 干粉需要低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，有效期一年。

自備試劑

膜蛋白溶解液(取決于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)為 SDS-PAGE,，則用 1× SDS-PAGE 上樣液作為溶解液；如果用于 2D 電泳,，則使用 1×等電點(diǎn)電泳上

樣液作為溶解液),。

使用方法：

準(zhǔn)備：第一次使用本試盒時(shí)要將所有 DNase I 干粉倒入 B 中，輕柔顛倒使 DNase I 干粉溶解,。未用完的部分需要放-20℃保存,，最好在一個(gè)月內(nèi)完，否則 DNase 將逐漸失去活性,。此外,，最好在實(shí)驗(yàn)前 1 小時(shí)將細(xì)菌膜蛋白純化細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 C 冰浴預(yù)冷。

用法一：小量制（用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 等實(shí)驗(yàn)）

1.     收集 20-40 mL 過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液（OD420 在 1.5 左右即可）,，2500g 室溫離心 10 分鐘后棄上清,。

2.加入 2 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A,，輕柔吹打，將細(xì)菌重懸于細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A 中,。

3.2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清,。

4.加入 0.5 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 B（必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細(xì)菌重懸,。注：如果細(xì)菌起始量沒(méi)有 20-40 mL,，細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A 中的細(xì)菌可以放-80℃長(zhǎng)期保存,。

5.用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞,，直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。如果用 French Press 方法,，則需要處理至少兩次,，每次的壓力為 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不論用哪種裂解方法,，都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解,，否則還需要重復(fù)細(xì)菌裂解過(guò)程。

6.2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中（如 BeckmanOptima 臺(tái)式超速離心機(jī)離心管）,，棄沉淀（未破裂細(xì)胞）,。

7.在上清(細(xì)菌裂解液)中加入 5 mL 預(yù)冷的細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 C，輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘,。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次,。

8.用 BechmanOptima 臺(tái)式超速離心機(jī)在 115，000 g,， 4℃下離心 60 分鐘,。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致,，否則有可能得不到沉淀,。

9.小心移棄上清，在沉淀中加入 0.2 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A,，充分吹打混勻,。

10.用 BeckmanOptima 臺(tái)式超速離心機(jī)在 115，000 g,， 4℃下離心 60 分鐘,。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致,，否則有可能得不到沉淀,。

11.小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長(zhǎng)期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自備的,，跟后續(xù)實(shí)驗(yàn)兼容的緩沖液(如 1×SDS-PAGE 上樣液中,，可從本公司購(gòu)買(mǎi))，所得膜蛋白的濃度將在 1 mg/mL 左右,。

用法二：大量制備（要用于上樣量比較的 2D 電等實(shí)驗(yàn)）

12.收集 200-400 mL 過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液(OD420 在 1.5 左右即可),，2500g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

13.加入 20 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A,，輕柔吹打,，將細(xì)菌重懸于細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A 中。

14.2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清,。

15.加入 5 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 B（必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細(xì)菌重懸,。注：如果細(xì)菌起始量沒(méi)有 200-400 mL,，細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A 中的細(xì)菌可以放-80℃長(zhǎng)期保存,。

16.用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞,，直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。如果用 French Press 方法,，則需要處理至少兩次,，每次的壓力為 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不論用哪種裂解方法,，都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解,，否則還需要重復(fù)細(xì)菌裂解過(guò)程。

17.2500 g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的玻璃燒杯中,，棄沉淀(未破裂細(xì)胞),。

18.在上清（細(xì)菌裂解液）中加入 50 mL 預(yù)冷的細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 C， 輕輕在冰浴中攪拌混勻 30-60 分鐘,。注：可以在大燒杯中裝冰,，然后將裝有樣品的小燒杯放入，在放入干凈的攪拌子,，以最-低速度攪拌,。

19.用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭在 115，000 g,， 4℃下離心 60 分鐘,。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī)，但離心力應(yīng)該一致,。

20.小心移棄上清,，在沉淀中加入 2 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A，充分吹打混勻。

21.用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭在 115,，000 g,， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機(jī),，但離心力應(yīng)該一致,。

22.小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長(zhǎng)期保存或溶解在 1 mL 自備的,，跟后續(xù)實(shí)驗(yàn)兼容的緩沖液(如 1×等電點(diǎn)電泳上樣液,，可從本公司購(gòu)買(mǎi))，所得膜蛋白的濃度在 1 mg/mL 左右,。

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