TOPO-TA Simple Lightning Cloning Kit

（不含酶切位點）

TOPO-TASimpleLightningCloningKitTOPO載體

目錄號：42115

產品內容：

保存條件：

-20℃,，存放 12 個月,，不影響使用效果。

產品簡介：

可在室溫條件下,，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆,，陽性率接近100%,，并且免冰浴,、免熱激、免藍白斑篩選,，還可以連接長達10kb的DNA片段。

克隆步驟（≤3kb 片段）：               簡化步驟（≤10kb 片段）-- 免復蘇,，免液體 LB

1、連接：室溫 5 分鐘,；                      1,、連接: 37℃連接 5 min。

2,、轉化：室溫 5 分鐘,；                      2、轉化：冰浴 5 min,，42℃熱激 1 min,，冰上 2 min。

3,、復蘇：180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘,；涂板。 3,、取全部菌液涂板,，37℃倒置培養(yǎng),。

操作步驟：

1.         PCR 產物的制備：

a.       引物要求：引物不能磷酸化。

b.     酶的選擇：根據需要選擇DNA 聚合酶,，該載體兼容PCR 產物的A 末端和平末端。

c.        電泳檢測 PCR 產物的量和質量：

①僅有目的條帶,，可直接進行連接反應，無需純化,；

②如果有多條帶，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;

③如果以質粒為模板的擴增,，則必須進行凝膠回收，因為模板質粒也會長出非目的菌落,。

2.         連接反應：

1） {C}室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：

不同大小插入片段的推薦用量：

加完試劑后,，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻）,，點甩離心收集所有液體在離心管底。

2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘,。連接產物可直接轉化感受態(tài)細胞,，或置于冰上備用。

3.         轉化,、復蘇,、涂板：

1）100ul 感受態(tài)細胞，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右）,，輕撣幾次將細胞均勻懸浮,。

2）      加入 10ul 連接液，輕輕混勻,，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘,。

3）    加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素),，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min。

（注意：大于 3kb 的片段,，振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘,，可以增加轉化子。或者用簡化步驟）

4）        取 200?l 菌液涂板(含氨芐青mei素 50-100ug/ml）,，培養(yǎng)過夜,。（為得到較多克隆，4000 rpm 離心 1 min,，吸棄掉部分上清，保留 100-150ul,，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）

注意：如果使用 5ul 體系,，各成分按照比例減半,，使用次數(shù)可以加倍。

4.         轉化子的篩選鑒定：

本制品陽性率相當高,，一般情況下，可以達到所見即所得,，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌,，轉化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入,。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序,。

1）   菌落 PCR 檢測：挑單菌落于 10ul 無菌水中，混勻,，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鑒定陽性克隆,。

        2）    用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來確定是否含有目的克隆,。

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