One Step Seamless Cloning Kit (單片段)

One Step Seamless Cloning Kit 無(wú)縫克隆

目錄號(hào)：42111

包 裝 量：

產(chǎn)品儲(chǔ)存：-20°C保存,，避免多次反復(fù)凍融

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

制品說(shuō)明：一步法無(wú)縫克隆試劑盒不依賴于T4連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點(diǎn)限制,，而直接用重疊片段重組的方法,，采用特殊的酶組合可以將任意方法線性化后的載體和與其兩端具有16-25bp重疊區(qū)域的PCR片段定向重組連接，可以30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)A末端或者平末端PCR產(chǎn)物片段高效定向無(wú)縫克隆至載體的任意位點(diǎn),。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.  30分鐘可以將一個(gè)50bp-15kb PCR擴(kuò)增片段（平/A末端）克隆插入任意載體的任意位置,。

2.不受載體和插入片段酶切位點(diǎn)的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位點(diǎn)進(jìn)行克隆,。

3.  無(wú)縫克隆,，插入點(diǎn)不會(huì)引入不需要的堿基序列。

4.  不依賴于連接酶及磷酸酶,，高效,，準(zhǔn)確，克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上,。

一步法無(wú)縫克隆試劑盒原理示意圖：

線性化載體和插入DNA片段的制備：

A：線性化載體的制備

(1). 酶切來(lái)源：酶切所得線性載體,，平末端或者粘端、單酶切或者雙酶切均可,，酶切后膠回收,。

注： 一步法無(wú)縫克隆反應(yīng)體系內(nèi)無(wú)雙鏈DNA連接酶，不會(huì)發(fā)生載體自連反應(yīng),。因此,，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無(wú)需進(jìn)行末端脫磷酸處理。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)的假陽(yáng)性克隆 (無(wú)插入片段) 是由酶切不wan全未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的,。我們推薦酶切后膠回收可以把這種未線性化載體比例降低到zui低程度,。

(2). 反向PCR來(lái)源：建議使用高保真DNA聚合酶（貨號(hào)：P517-05或者P812-05）制備,，如果擴(kuò)增條帶單一可以通過(guò)PCR產(chǎn)物純化（貨號(hào)：DC012-50）獲得載體，否則通過(guò)膠回收（貨號(hào)：DC011-50)獲得載體,。

注：反向PCR的質(zhì)粒模板也是非線性化載體,，也可能導(dǎo)致假陽(yáng)性克隆（無(wú)插入片段）,，因此PCR來(lái)源線性載體（PCR產(chǎn)物）純化前用Dpn I內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板,，可以降低背景，提高陽(yáng)性率,。但是一般情況下，經(jīng)過(guò)膠回收已經(jīng)足以把這種未線性化載體比例降低到zui低,，因此反向PCR來(lái)源的線性化載體我們也推薦膠回收,。

B：插入DNA片段的制備

(1). 一步法無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)總的原則是：通過(guò)在引物5’ 端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)的wan全一致的序列 (16 bp～20 bp),。

(2). 插入片段引物設(shè)計(jì)：克隆引物包括插入片段特異性引物序列和重疊序列,。

克隆正向引物(5’-3’)：線性載體正向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段正向特異引物序列（18-25 nt）

克隆反向引物(5’-3’)：線性載體反向16-25 nt重疊區(qū)序列(3’末端算起)+插入片段反向特異引物序列（18-25 nt）

注意：重疊區(qū)的堿基數(shù)至少16 bp，并且多段重疊區(qū)域之間的Tm值需保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C),，否則可延長(zhǎng)堿基數(shù)目直到符合要求,。

按照線性載體末端的結(jié)構(gòu)（5’突出，3’突出,，平末端）,，引物設(shè)計(jì)也分3種情況，示意如下：

線性化載體的兩端因線性方式（如單酶切,、雙酶切,、反向PCR）不同，可以是以上三種末端結(jié)構(gòu)的兩兩任意組合,，插入片段特異性引物設(shè)計(jì)的原則遵循一般引物設(shè)計(jì)的原則即可,。

計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值,，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算,。

(3). 酶的選擇：建議使用高保真DNA聚合酶或者PCR Mix（貨號(hào)：P517-05或者P814-05）。

(4). 反應(yīng)條件：一般按照具體使用的聚合酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行即可,。

(5). 純化插入片段

l   可選：如果片段來(lái)源于質(zhì)粒模板,，且該質(zhì)粒與重組載體具有相同抗性，純化前用Dpn I內(nèi)切酶消化質(zhì)粒模板,， 可降低背景,，提高陽(yáng)性率。

l   如果片段單一,，則建議用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（貨號(hào)：DC012-100）純化片段,。

l   如果有非特異擴(kuò)增,，則建議用膠回收試劑盒（貨號(hào)：DC011-100)回收片段。

l   使用該方法克隆,，用來(lái)線性化載體的酶切位點(diǎn)在拼接的時(shí)候會(huì)缺失,，如果對(duì)酶切位點(diǎn)有嚴(yán)格要求的，建議注意酶切位點(diǎn)的選擇,，必要時(shí)可在正反向克隆引物的重疊區(qū)序列和特異基因序列之間增加缺失掉的堿基來(lái)恢復(fù)原有酶切位點(diǎn)（見(jiàn)后面舉例說(shuō)明）,。

l   如果重組質(zhì)粒用于蛋白表達(dá)，則在引物設(shè)計(jì)時(shí)注意讀碼框,，蛋白表達(dá)及純化所需序列（如啟動(dòng)子,，RBS序列，起始密碼子,，終止密碼子,，蛋白標(biāo)簽等）不被破壞。

正向引物設(shè)計(jì)舉例說(shuō)明（EcoR I 酶切開(kāi)）：

如上圖,，載體由Ecor I 酶切開(kāi),，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設(shè)計(jì)原則，從3’端開(kāi)始計(jì)算,，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列）,，加到目的片段特異引物序列前面即可。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C),。

正向引物具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設(shè)計(jì)完成克隆連接后,，EcoR I 酶切位點(diǎn)將會(huì)消失（不保留酶切位點(diǎn)）。

如果需要保留 EcoR I 酶切位點(diǎn),，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補(bǔ)齊缺失的EcoR I 識(shí)別位點(diǎn)序列aattc,，完成克隆連接后，EcoR I 酶切位點(diǎn)依然存在（保留酶切位點(diǎn)）,。

具體如下：5' — GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

反向引物設(shè)計(jì)舉例說(shuō)明（Hind III 酶切開(kāi)）：                           

如上圖,，載體由Hind III 酶切開(kāi)，形成5’突出末端：

根據(jù)上述設(shè)計(jì)原則,，從3’端開(kāi)始計(jì)算,，往回算16bp-25bp（本舉例采用了20 bp末端重疊相同序列），加到目的片段特異引物序列前面即可,。確保重疊區(qū)域的Tm值保持一致且﹥60°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C),。

反向引物具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

注意：以上引物設(shè)計(jì)完成克隆連接后，Hind III 切位點(diǎn)將會(huì)消失（不保留酶切位點(diǎn)）,。

如果需要保留 Hind III 酶切位點(diǎn),，需要在載體末端20 bp重疊序列和目的片段特異引物序列之間補(bǔ)齊缺失的Hind III 識(shí)別位點(diǎn)序列agctt ，Hind III 酶切位點(diǎn)依然存在（保留酶切位點(diǎn)）,。

具體如下：5' — CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN —3'

無(wú)縫克隆反應(yīng)的操作步驟：

注意：2 × OneStep Cloning Mix 含有連接增強(qiáng)劑PEG很粘稠,，從冰箱拿出來(lái)溫度低時(shí)更粘稠,，可以放在手心化凍幾分鐘提高溫度便可降低粘稠度（不影響質(zhì)量），輕彈混勻,，瞬間離心收集到管底,。

1.   按照下表建立反應(yīng)體系（可使用PCR管在室溫配制）

* 載體一般用20-50 ng，插入片段與載體的摩爾比在2:1-3:1之間最佳,；如果插入片段小于200bp,，插入片段與載體的摩爾比用5:1 。

2.      輕輕混勻,，在50°C反應(yīng)15分鐘（可在PCR儀器上進(jìn)行）,，反應(yīng)結(jié)束后，將PCR管置冰上后直接轉(zhuǎn)化或者保存于-20°C,。較短片段例如100bp-1kb只需要15分鐘便能獲得足夠轉(zhuǎn)化子,，較長(zhǎng)片段的連接，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到60分鐘,。

3.     取5μl 反應(yīng)產(chǎn)物按照感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化（如果轉(zhuǎn)化子較少，可以將所有的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并將所有的轉(zhuǎn)化液涂板）,。

陽(yáng)性克隆的鑒定：

可根據(jù)具體情況,，選擇菌落PCR鑒定，提取質(zhì)粒（貨號(hào)31013-100）進(jìn)行限制性內(nèi)切酶鑒定或測(cè)序鑒定,。

One Step Seamless Cloning Kit 無(wú)縫克隆