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無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量快速提試劑盒

無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量提取試劑he 核酸提取

目錄號：31110

產(chǎn)品內(nèi)容:

保存條件:

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下,，可保存 12 個月。

RNase  A,、內(nèi)毒素清除劑,，可常溫運輸，-20℃保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品簡介：

無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒可提取 5-15ml 菌液,，采用改進的 SDS-堿裂解法裂解細胞，通過du特的內(nèi)毒素清除劑選擇性結合離心除去內(nèi)毒素,，然后離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽,、低 pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質(zhì)粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除,，最后低鹽,、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。所得質(zhì)?？芍苯佑糜趍ei切,、轉(zhuǎn)化、PCR,、RT-qPCR,、測序及轉(zhuǎn)染等分子生物學實驗。

產(chǎn)品特點:

1.      du特工藝配方清除內(nèi)毒素,，內(nèi)毒素含量極低（<0.1 EU/ug DNA）,，細胞轉(zhuǎn)染效果ji佳。

2.        得率高： 5 – 15 ml 菌液可提出多達 30 – 90 ug 的純凈質(zhì)粒,。

重要提示：

一,、使用前請先檢查平衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現(xiàn)渾濁,，如有混濁現(xiàn)象,，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘,，即可恢復澄清。

二,、首ci使用前請先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入無水乙chun（詳見瓶身的標簽）,，混勻,。

三、首ci使用時請先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中,，混勻,，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1.       柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 100 ul 的平衡液,，12,000 rpm 離心 1 min,，棄收集管中濾液，將吸附柱重新放回收集管中,。

2.   取 5 ~ 15 ml 過夜培養(yǎng)的菌液,，室溫 9,000 rpm 離心 2 min，盡量倒干上清,，收集菌體,。

（注意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量，濃度高時取 5 ml 菌液離心即可,，濃度低時可多收集一次）

3.  加入 500 ul 溶液P1,，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至che底懸浮,。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會影響裂解,，導致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

4.  加入 500 ul 溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次,，使菌體充分裂解,，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩,，以免造成基因組 DNA 片段的污染,，所用時間不要超過 5 min，以免質(zhì)粒受到破壞,，如未wan全變得清亮,，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量,，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應增加）

5. 加入 500 ul 溶液 N3,，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀,，

然后室溫 13,000 rpm 離心 10 min,，小心取上清至新管,，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 P3 后應立即混合,，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

6. 加入 0.1 體積 (上清的體積的 10%,，約 160 ul ) 的內(nèi)毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒旋轉(zhuǎn)混勻,，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘,，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次,。

（注意：內(nèi)毒素清除劑加入上清后,，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮,或稍渾濁,。）

7. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘,，溫度恢復室溫溶液很快變?yōu)闇啙幔嵉够靹?/span>,。（37℃可加速渾濁）

8. 室溫 15,000 rpm 離心 10 分鐘分相 ,。上層水相含 DNA，下層藍色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì),。將含 DNA 的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍色油狀層,，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)），棄油狀層,。

9. 向上層水相中加入 0.5 倍體積的異丙chun（約 740 ul）,，充分顛倒混勻，分兩次（每次不超過 700 ul）轉(zhuǎn)入吸附柱中（吸附柱放入收集管中）,，12,000 rpm 離心 1min,，質(zhì)粒被吸附在膜上，倒掉收集管中的濾液,。直到所有混合溶液通過此吸附柱,。

10.     可選步驟：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec,，棄濾液,。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無水乙chun,，用后應立即蓋緊瓶蓋,，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α,，此步驟可省略,。如果宿主菌是 endA+，如 TG1,、BL21,、 HB101,、JM101 等，此步驟不可省略,，因這些宿主菌含有大量的核酸mei,，易降解質(zhì)粒。如果提取低拷貝質(zhì)粒也推薦采用此步驟）

11.      加入 600 ul 漂洗液 WB,，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec,，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液,，按要求加入無水乙chun，用后應立即蓋緊瓶蓋,，以防酒精揮發(fā)）

12.      重復步驟 11 一次,。

13.      室溫 12,000 rpm 離心 2 min，甩干殘留液體,，以免殘留乙chun抑制下游反應,。

14.     將吸附柱置于一個新的 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 100 ~ 200 ul 的洗脫緩沖液 EB,，室溫放置 2 min,，12,000 rpm 離心 1 min，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA,。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預熱洗脫緩沖液 EB,，可增加洗脫效率；

如果需要較多量質(zhì)粒,，可將得到的溶液重新加入吸附柱中,，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫,，可用 NaOH 調(diào)整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間,。）

無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量提取試劑he 核酸提取