EndoFree Plasmid Mini Kit

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量快速提試劑盒

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒 核酸提取

目錄號(hào)：31014

產(chǎn)品內(nèi)容;

保存條件:

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下,，可保存 12 個(gè)月,。

RNase  A、內(nèi)毒素清除劑,，可常溫運(yùn)輸,，-20℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒采用改進(jìn)的 SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,，通過(guò)du特的內(nèi)毒素清除劑選擇性結(jié)合離心除去內(nèi)毒素，然后離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽,、低 pH 值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA,，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，zui后低鹽,、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫,。所得質(zhì)粒可直接用于mei切,、轉(zhuǎn)化,、PCR、RT-qPCR,、測(cè)序及轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),。

產(chǎn)品特點(diǎn):

1. du特工藝配方清除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素含量極低（< 0.1 EU/ug DNA）,，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果ji佳,。

2.       得率高：1.5 - 4.5ml 菌液可提出多達(dá) 20 - 50 ug 的純凈質(zhì)粒；

重要提示：

一,、使用前請(qǐng)先檢查平衡液,、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象,，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘,，即可恢復(fù)澄清。

二,、第一次使用前,，請(qǐng)先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入無(wú)水乙chun,，請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽,。三,、shou次使用時(shí)請(qǐng)先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻,，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存,。

操作步驟：

1.       柱平衡：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入 100 ul 的平衡液，12,000 rpm 離心 1 min,，棄收集管中濾液,，將吸附柱重新放回收集管中。

2.   取 1 ~ 5 ml 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液,，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec,，盡量倒干上清，收集菌體,。

（注意：根據(jù)菌液的濃度決定取液量,，濃度高時(shí)取 1.5 ml 菌液離心即可，濃度低時(shí)可多收集一次）

3.  加入 250 ul 溶液P1,，重懸菌體沉淀,，渦旋震蕩至che底懸浮。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會(huì)影響裂解,，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度降低）

4.  加入 250 ul 溶液P2,，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次，使菌體充分裂解,，室溫放置 4 min,。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染,，所用時(shí)間不要超過(guò) 5 min,，以免質(zhì)粒受到破壞，如未wan全變得清亮,，可能是菌體太多,，可增加溶液 P2 的用量，在后續(xù)的操作中溶液 P3 的用量也要相應(yīng)增加）

5. 加入 250 ul 溶液 N3,，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 6-8 次,，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，

然后室溫 13,000 rpm 離心 10 min,，小心取上清至新管,，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 P3 后應(yīng)立即混合,，避免產(chǎn)生 SDS 的局部沉淀）

6.  加入 0.1 體積 (上清的體積的 10%,，約 80 ul) 的內(nèi)毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒

旋轉(zhuǎn)混勻,，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘,，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁）,，中間偶爾混勻幾次。

（注意：內(nèi)毒素清除劑加入上清后,，上清會(huì)變得渾濁,，但是冰浴后應(yīng)恢復(fù)清亮,或稍渾濁。）

7. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘,，溫度恢復(fù)室溫溶液很快變?yōu)闇啙?，顛倒混?/span>。（37℃可加速渾濁）

8. 室溫 15,000 rpm 離心 10 分鐘分相 ,。上層水相含 DNA,，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。將含 DNA 的上層水相轉(zhuǎn)移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層,，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)）,，棄油狀層。

9. 向上層水相中加入 0.5 體積異丙chun（約 370 ul）,，充分顛倒混勻,，分兩次（每次不超過(guò)

700 ul）轉(zhuǎn)入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 離心 1min,，質(zhì)粒被吸附在膜上，倒掉收集管中的濾液,，直到所有混合溶液通過(guò)此吸附柱,。

10.     可選步驟：向吸附柱中加入 500 ul 去蛋白液 PE，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec,，棄濾液,。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無(wú)水乙chun,，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋,，以防酒精揮發(fā)）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α,，此步驟可省略,。如果宿主菌是 endA+，如 TG1,、BL21,、 HB101、JM101 等,，此步驟不可省略,，因這些宿主菌含有大量的核酸mei，易降解質(zhì)粒,。如果提取低拷貝質(zhì)粒也推薦采用此步驟）

11.      加入 600 ul 漂洗液 WB,，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec,，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液,，按要求加入無(wú)水乙chun,，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發(fā)）

12.      重復(fù)步驟 11 一次,。

13.      室溫 12,000 rpm 離心 2 min,，甩干殘留液體，以免殘留乙chun抑制下游反應(yīng),。

14.     將吸附柱置于一個(gè)新的 1.5 ml 離心管（自備）中,，加入 50 ~ 100 ul 的洗脫緩沖液 EB，室溫放置 2 min,，12,000 rpm 離心 1 min,，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預(yù)熱洗脫緩沖液 EB,，可增加洗脫效率,；

如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中,，再次離心 1 min 收集,；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調(diào)整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間,。）

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒 核酸提取