選擇性凋亡DNA Ladder抽提試劑盒

選擇性凋亡DNA Ladder抽ti試劑盒 核酸提取

目錄號：40117

試劑盒組成、儲存,、穩(wěn)定性：

注意事項：

為保持活性方便運輸,，Enzyme B客戶收到時為凍干粉，收到后加500µl滅菌水（25次）或者1ml滅菌水（50次）溶解后－20 oC保存,。Enzyme A和Enzyme B為mei溶液,，應(yīng)該避免反復(fù)凍融降低活性，如果要分多次使用,，zuihao按照每次使用量分裝后－20 oC保存,。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品介紹：

凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細胞一個形態(tài)學(xué)的顯著特點是染色體DNA以核小體為單位（185 bp）規(guī)律斷裂形成長度約為n×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA Ladder,，是凋亡細胞zui直觀的特征,。本試劑盒選擇性從組織和細胞中分離提取凋亡DNA ladder，通過選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，zui大限度的減少了基因組DNA對凋亡DNA ladder的觀察干擾,，因此顯著的提高了檢測敏感度,，反應(yīng)可在微量離心管進行，2.5小時完成,，快速方便,；無需有機抽提，檢測靈敏度ji高,，可從約2000個凋亡細胞中檢測到DNA ladder,。推薦起始細胞量為5～10 × 10⁵ 個，但投入的細胞量可在1 × 10⁵ ~ 5 × 10⁶之間變化,。原則是總細胞中應(yīng)含有至少約1～2 × 10⁴個凋亡細胞,。多于2 × 10⁴個凋亡細胞通常可獲得十分清晰的凋亡DNA ladder,。本試劑盒也可用于從組織中提取凋亡DNA ladder,。但與培養(yǎng)細胞相比，整體動物組織凋亡細胞出現(xiàn)的時間,、部位,、程度等規(guī)律性差往往造成難以準(zhǔn)確取材，可能顯著影響實驗結(jié)果,。但只要組織確實發(fā)生凋亡,，有經(jīng)驗的用戶也可以使用本試劑盒從組織提取凋亡DNA ladder (參見說明4)。

產(chǎn)品說明:

1.        溴化乙錠染色過度將降低DNA條帶檢測靈敏度,，可用水沖洗凝膠10～30分鐘,。如沖洗過頭可再用溴化乙錠復(fù)染?？捎酶`敏的DNA染色劑SYBR Green,。也可進行丙烯酰胺DNA凝膠電泳和DNA銀染。

2.        對細胞進行干預(yù)處理后,，凋亡可能僅在某一時間點或某一干預(yù)強度下zui為明顯,。需要進行預(yù)試驗確定zuijia干預(yù)時間或強度。此時也可用凋亡小體/hoeschst染色試劑盒(DN1801)快速染色凋亡小體觀察,。

3.        推薦起始細胞量為5～10 × 10⁵ 個,，但投入的細胞量可在1 × 10⁵ ~ 5 × 10⁶之間變化。原則是總細胞中應(yīng)含有至少約1～2 × 10⁴個凋亡細胞,。多于2 × 10⁴個凋亡細胞通?？色@得十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔板的一個孔相當(dāng)于一個35 mm培養(yǎng)皿長滿后可得到1～10 ×10⁵ 個細胞,，如果細胞凋亡發(fā)生率為10%,，經(jīng)過處理可得到約1～10 × 10⁴個凋亡細胞,，應(yīng)該足以獲得清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能從>3 ×10⁶個細胞獲得清晰的凋亡DNA ladder,，表明其中凋亡細胞少于1%。此時增加細胞用量也難已奏效,。

4.        從組織塊提取凋亡DNA ladder,。取10～20 mg組織塊放入小玻璃勻漿器，加100～200μl Extraction buffer,，上下手動勻漿15～20次,。取出勻漿液，冰上5～10 min,。振蕩10秒,。4500 rpm 10分鐘收集上清液并轉(zhuǎn)移到新1.5ml離心管，執(zhí)行提取步驟3,。另外一種方法是將30～50mg組織jian碎后在PBS里面勻漿,，制成細胞懸液，離心收集細胞后接步驟2繼續(xù)執(zhí)行提取,。

5.        采用高質(zhì)量瓊脂糖,，使用寬度較小和厚度較窄的樣品梳子，制作較薄的瓊脂糖凝膠(厚度約2～4 mm),；用較低的電壓進行慢速電泳,，將顯著增加凋亡DNA條帶檢測靈敏度。電泳距離不要太長,，否則將使小的凋亡DNA條帶彌散而降低分辨率,。

操作步驟：

1.        用PBS漂洗細胞兩遍后微型離心機500 ×g 4oC 5 min收集5～10 × 10⁵個細胞（zuihao同時做一個未凋亡細胞的對照）。小心用移液槍吸棄上清,，除盡管壁附著液體,。

2.        將離心管底部的細胞沉淀用手指輕輕彈松打散后，加入100µl的Extraction buffer,，用振蕩器激烈混合10秒鐘后,，1,100～1,600 xg(約3500～4500 rpm)離心5分鐘。

3.        勿觸動管底沉淀,，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管,。

4.        沉淀按操作2.方法再重復(fù)一次。

5.        把上清液與操作3.的上清液合并于一起共約200µl,，作為粗提取液(含有凋亡DNA片段,，未凋亡染色體DNA已經(jīng)通過沉淀去除)。

6.        向粗提取液中加入10% SDS 溶液 20µl后,，再加入Enzyme A 20µl,，混勻,，56℃溫育1小時。

7.        向上述混合液中加入Enzyme B 20µl,，混勻,37℃溫育1小時,，或者直到變得透亮（可過夜）。

8.        向上述混合液中加入Precipitant 130µl后,，顛倒混勻,，再加入1 ml的乙chun，混勻后- 20℃放置1小時以上（沉淀凋亡DNA片段）,。

9.        至少13000rpm 4oC離心15min,，棄上清，加1ml 70％乙chun漂洗一遍后離心,，倒去乙chun,，并且盡量吸除管壁附著液體。敞開管口,，室溫晾干沉淀,。

10.     用17µl雙蒸水或TE Buffer充分溶解沉淀，加3µl 6 x DNA凝膠上樣緩沖液震蕩混勻,。取全部20µl 上樣或者適量上樣進行1% agarose gels電泳,。溴化乙錠染色，紫外觀察照相（凋亡發(fā)生率較低時,，添加過量TE Buffer溶解沉淀有可能會導(dǎo)致濃度太稀,，無法檢出DNA Ladder，因此可減少用量,，反之,，可增加）。

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