脯an酸（PRO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

Pro 廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，逆境條件下，植物體內(nèi)Pro 含量顯著增加,。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性,，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯an酸。因此,，脯an酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一,。

測(cè)定原理：

用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理后,，Pro 與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色,；加甲苯萃取后，在 520nm 測(cè)定吸光度,。

脯an酸（PRO）含量測(cè)定試劑盒   抗逆系列

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、冰乙酸 25ml、甲苯 50ml,、研缽,、冰和蒸餾水。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

1,、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,；之后置 95℃水浴振蕩提取 10min,；10000g， 25℃離心 10min,，取上清,，冷卻后待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，加入 1ml 提取液），勻漿,；之后置 95℃水浴振蕩提取 10min,；10000g，25℃離心 10min,，取上清,，冷卻后待測(cè)。

2,、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（ml）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議取 0.1ml 血清（漿）加入 1ml 提取液）,，充分混勻，之后置 95℃水浴振蕩提取 10 分鐘,，10000g,，25℃離心 10 分鐘，取上清,，冷卻后待測(cè),。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 520nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、樣本測(cè)定：

(1) 取0.25ml 樣本+0.25ml 試劑一+0.25ml 試劑二 于有蓋EP 管中,，置 95℃水浴中保溫 30min（蓋緊,，防止水分散失），每 10min 振蕩一次,。

(2) 待冷卻后,，加入 0.5ml 試劑三，振蕩 30s,，靜置片刻,，使色素轉(zhuǎn)至試劑三中；吸取 0.2ml 上層溶液于微量石英比色皿或 96 孔板中,，于 520nm 波長(zhǎng)處比色,，記錄吸光值 A。

Pro 含量計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1,、典型回歸方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 為脯an酸含量,，μg/ml；y 為吸光值A)

2,、按照血清（漿）體積計(jì)算

Pro 含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3,、按照蛋白濃度計(jì)算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

Pro 含量(µg/g 鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5,、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

Pro 含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.25ml；V2：加入提取液體積,，1 ml,；V3：加入血清（漿）體積，0.1 ml,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn),。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1,、典型回歸方程 y = 0.02605x - 0.0021 (x 為脯an酸含量，μg/ml,；y 為吸光值A)

2,、按照血清（漿）體積計(jì)算

Pro 含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)

3,、按照蛋白濃度計(jì)算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

Pro 含量(µg/g 鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3,、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

Pro 含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.25ml；V2：加入提取液體積,，1 ml,；V3：加入血清（漿）體積，0.1 ml,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/ml；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn),。

注意：zui低檢測(cè)限為 1μg/ml 或 1μg /g 鮮重 或 0.01μg /mg prot

脯an酸（PRO）含量測(cè)定試劑盒   抗逆系列