諾博萊德  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase

T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase   核酸檢測(cè)

產(chǎn)品貨號(hào)：T9298

產(chǎn)品名稱：T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase

英文名稱：T4 DNA ligase

產(chǎn)品別名：T4 DNA連接試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：60U

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：Store at -20℃

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderT9298  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase特性：

高效連接粘性末端和平末端

T/A 克隆

dsDNA 切刻修復(fù)

構(gòu)建高豐度克隆文庫

RNA 和 DNA 的連接

概述：

該酶催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5′-磷酸末端和 3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵,。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接,，還可以修復(fù)雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻,。

來源：

純化自 E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8,。

反應(yīng)條件：

1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液

[50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃），10 mM MgCl2,，10 mM DTT,，1 mM ATP]。推薦 DNA 5′ 末端濃度為 0.1-1.0 μM,，16℃ 溫育,。

熱失活：65℃ 10 分鐘。

單位定義（粘性末端活性單位）：

1 單位指在 20 μl 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液中,，16℃ 反應(yīng)條件下,，30 分鐘能使 50% 的經(jīng) HindⅢ 消化的λDNA 片段 [ 5′ 端濃度為 0.12 μM（300 μg/ml）] 連接所需的酶量。

注意事項(xiàng)：

與 E. coli DNA 連接酶需要 NAD+ 作輔因子不同,，T4 DNA 連接酶的輔因子是 ATP,。

稀釋后的 T4 DNA 連接酶應(yīng)于 -20℃、50% 甘油貯存緩沖液（稀釋緩沖液 A,，NEB #B8001）中保存,。如稀釋后馬上使用，也可用 1X T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液稀釋,。

只要在反應(yīng)體系中補(bǔ)加 1 mM ATP,，連接反應(yīng)就可以在 NEB 提供的四種限制性內(nèi)切酶緩沖液或在T4 DNA 多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行。

使用示例：

1,、先將 10×T4DNALigaseBuffer 在冰上融化,，并進(jìn)行短暫的離心。

2,、以 20μL 連接體系示例,，在無菌微量離心管中加入以下各種成分：

【注】：平末端載體與DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)先將載體進(jìn)行去磷酸化處理,，以防發(fā)生自連接現(xiàn)象,。為提高連接效率，每20µL反應(yīng)體系中可以加2µL50%PEG4000,。

3,、16℃連接過夜,。

4、轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

1）將連接產(chǎn)物加入到100µL 感受態(tài)細(xì)胞中（連接產(chǎn)物不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞的1/10）,，輕彈混勻,，冰上孵育30min。

2）將離心管于42℃,，熱激90sec（不要晃動(dòng)）,，之后立刻置于冰水浴靜置2-3min。

3）向離心管中加入900µLLB或SOC培養(yǎng)基,，37℃,，150rpm，振蕩培養(yǎng)45min,，該過程使菌體復(fù)蘇,，抗性基因表達(dá)。

4）2500 g 離心5min,，吸去900µL上清,，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體，用無菌涂布棒將剩余菌體在正確抗性的平板上涂布均勻,，待菌液被平板吸收后,，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

【注】：如果使用超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（轉(zhuǎn)化效率＞108cfu/µg）,，可直接吸取100-200µL37℃孵育后的菌液涂板,，剩余菌液可在4℃保存,，1周內(nèi)均可重新涂板,。

注意事項(xiàng)：

1、10×T4DNALigaseBuffer 中含有 ATP,，為避免 ATP 的降解,，建議解凍后分裝凍存于-20℃。

10×T4 DNA Ligase Buffer 在融解時(shí),，如果出現(xiàn)少量沉淀屬正?，F(xiàn)象，請(qǐng)顛倒混勻后使用,。

2,、平末端的載體與 DNA 片段連接時(shí)，應(yīng)首先對(duì)載體進(jìn)行去磷酸化,，以防止載體自身環(huán)化,。

注意：如果向反應(yīng)體系中加入 PEG 可以促進(jìn)平末端的連接，但 PEG 可能導(dǎo)致cDNA 片段克隆產(chǎn)物 出現(xiàn)串聯(lián)體并抑制包裝的反應(yīng),。

3,、為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4,、本產(chǎn)品僅作科研用途,！

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T9298  T4 DNA 連接酶 T4 DNA ligase  60U