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NCI-N87人胃癌細(xì)胞（STR鑒定）

細(xì)胞介紹

NCI-N87細(xì)胞表達(dá)表面糖蛋白癌胚抗原(CEA)和TAG 72, 并且沒(méi)有左旋多巴胺脫羧酶(DDC)活性。它們的血管活性的腸肽(VIP)受體活性極低并缺乏胃泌激素受體,。 它們表達(dá)蕈毒堿膽堿受體,。沒(méi)有證據(jù)表明存在N-myc, L-myc, myb和EGF受體基因的重組,。這個(gè)細(xì)胞株表達(dá)的c-myc和c-erb-B 2 RNA水平與其它細(xì)胞株相當(dāng)。以下基因不表達(dá): N-myc, L-myc, c-cis, IGF-2, 或胃泌激素釋放肽,。據(jù)報(bào)道NCI-N87 細(xì)胞的植板率為4.3%,。

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：胃癌，肝轉(zhuǎn)移

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣,，貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x106 細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用,。

運(yùn)輸和保存：干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系,。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作,。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請(qǐng)?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài),，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù),。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況,。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的專(zhuān)用培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上,，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中,，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收,。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的專(zhuān)用培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1) 準(zhǔn)備1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基                                  87 %

優(yōu)質(zhì)胎牛血清                                  10 %

P/S青霉素-鏈霉素                                1%

GlutaMAX-1谷氨酰胺                             1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉                          1%

注意事項(xiàng)：該細(xì)胞貼壁較慢,，且生長(zhǎng)緩慢，建議復(fù)蘇,、傳代后讓細(xì)胞貼壁48h后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作,。細(xì)胞最初將附著形成小島狀，然后在這些密集的斑塊中增殖,，因此很難正確估計(jì)匯合度,。避免細(xì)胞過(guò)密生長(zhǎng)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基,，以免培養(yǎng)基的pH受到不利影響,。該細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中會(huì)有一些漂浮細(xì)胞和碎片,，并且在該細(xì)胞中可能會(huì)觀察到較大的“囊泡"和顆粒狀外觀,，是正常現(xiàn)象,。

1） 培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%,；二氧化碳,，5%。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

2） 凍存液：90%血清，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二．細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL專(zhuān)用培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液，專(zhuān)用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml專(zhuān)用培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間）,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化,。 

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中,，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的專(zhuān)用培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用,。下面T25瓶為例,；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度,。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清,。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ,，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng),、代數(shù),、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,，-80度冰箱中過(guò)夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用,。

注意事項(xiàng)：

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄,。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套,、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒(méi)在液氮中會(huì)泄漏,，并會(huì)慢慢充滿液氮,。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子,，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害,。

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