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支原體PCR檢測試劑盒

Mycoplasma PCR Detection Kit

支原體PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品優(yōu)勢

●高廣譜性,，可檢測所有可能含有支原體的樣品

●高靈敏度,，可檢測低至10 copies的支原體

●高特異性,，真核生物、細(xì)菌的基因組不會(huì)被檢測

●高保真性,，本試劑盒含有陽標(biāo)和陰標(biāo),，可有效避免PCR反應(yīng)假陰性和假陽性

●操作簡易，本試劑盒的預(yù)混體系包含PCR反應(yīng)所需試劑

●耗時(shí)短,，本試劑盒能夠在2小時(shí)內(nèi)完成支原體檢測

產(chǎn)品用途  《支原體PCR檢測試劑盒》可用于檢測所有可能含有支原體污染的樣品,，例如：細(xì)胞培養(yǎng)的上清；血清,；胰酶,；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；體液樣品,；其他樣品,。

產(chǎn)品描述

支原體是最小的原核生物，其大小介于細(xì)菌和病毒之間,，約為0.1~0.3μm,，且具有變形能力，可透過常見過濾膜（0.22~0.45μm）,，因此常規(guī)的無菌過濾方法不能將其去除,；無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),，常規(guī)抗生素對(duì)其生長無法起到抑制作用；支原體在生長過程中是依靠宿主提供營養(yǎng),，吸附在細(xì)胞表面或之間,，即為細(xì)胞污染物中最為主要的污染。由于支原體會(huì)使宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生變化,，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢,、分化和衰老死亡等現(xiàn)象，所以支原體污染檢測是細(xì)胞制劑品或細(xì)胞科研的基礎(chǔ)檢測,。支原體PCR檢測試劑盒是優(yōu)選直擴(kuò)式PCR酶擴(kuò)增支原體基因組中保守16SrDNA而設(shè)計(jì)的,，不會(huì)擴(kuò)增細(xì)菌等其他基因組，兼具特異性和高靈敏性的特點(diǎn),，且本試劑盒檢測范圍廣,，可檢測：(1)M.Hyorhinis，(2)M.Fermentans,，(3)M.Arginini,，(4)M. hominis，(5)M. orale,，(6)M. salivarium,，(7)M.pirum，(8)Acholeplasma Laidlawii,，(9)M. agalactiae,，(10)M.bovis，(11)M. buccale,，(12)M. arthritidis,，(13)M.pulmonis等幾乎所有常見的污染細(xì)胞的支原體(注：M.為Mycoplasma的縮寫)。以上13種支原體約占細(xì)胞支原體污染的99%以上,。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種,。因此非常適合于與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的科研實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)的日常支原體檢測。
質(zhì)量控制     通過細(xì)菌,、真菌,、支原體、內(nèi)毒素檢測,。

R R        通過滲透壓,、pH 檢測。

R R        通過產(chǎn)品性能檢測,。

使用方法

1.樣品準(zhǔn)備

1.1 收集細(xì)胞培養(yǎng)液1mL,，1000rpm離心5min。

1.2 緩慢吸取950µL上清液，13000rpm離心5min,。

1.3 棄上清液,。緩慢操作，請勿倒置或吸取離心管底部,。
注：為增大檢測靈敏度或減少培養(yǎng)液中的成分對(duì)PCR反應(yīng)的抑制情況,，可選擇使用PBS清洗1至2次，13000rpm離心5min,，棄上清,。

1.4 加入50µL ddH 2 O，混勻后,，即為待測樣品,；若當(dāng)日不進(jìn)行檢測，95℃加熱5min,，存放于-20℃保存,。

2.實(shí)驗(yàn)環(huán)境消除支原體

2.1 使用75%酒精對(duì)所需實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行擦拭消毒。

2.2 使用去除支原體噴霧進(jìn)行去除支原體,，去假陽性污染源,。

2.3 紫外照射30min，通風(fēng)后方可使用,。

3.樣品檢測

3.1 分別吸取20µL預(yù)混液（PCR Master Mix,，含染料，藍(lán)色液體）至0.2mL PCR管中,，緩慢加入,，防止氣泡產(chǎn)生,。

3.2 將待檢測樣品和陽標(biāo)（PCR Positive,，紫蓋管）及陰標(biāo)（PCR Negative，白蓋管）分別按需加入預(yù)混體系進(jìn)行支原體檢測,。

注：操作時(shí)產(chǎn)生的微量氣溶膠即可造成樣品之間的相互污染,，因此須小心謹(jǐn)慎，避免劇烈操作,，為避免陽標(biāo)污染,，應(yīng)最后添加含陽標(biāo)各組。

3.3 建議檢測體系如下：

注：預(yù)混體系為反應(yīng)優(yōu)化的體系,，包含PCR所需的所有試劑,，并已添加染料（藍(lán)色），反應(yīng)后可直接進(jìn)行電泳檢測,。待檢測樣+陽標(biāo)反應(yīng)管能夠反映是否PCR反應(yīng)會(huì)被抑制,。建議檢測時(shí)設(shè)置復(fù)孔，復(fù)孔管是為了提高檢測的準(zhǔn)確性。

3.4添加所有待檢測樣品后,，振蕩器上混勻,，瞬時(shí)離心，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，反應(yīng)程序如下：

注：反應(yīng)循環(huán)盡量不要超過35個(gè),，過多的循環(huán)數(shù)會(huì)造成假陽性或雜帶?；驁?zhí)行TOUCHDOWN-PCR程序,，如下：

4.PCR產(chǎn)物檢測

4.1 配制1.5%瓊脂糖凝膠，加熱后加入適量GELRED用于紫外燈下顯色,。

4.2 吸取5µL PCR反應(yīng)后的樣品進(jìn)行上樣,，DNA marker上樣量為5µL。

4.3 電泳條件：電壓為120V,，20min左右（可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行時(shí)間調(diào)整）,。

4.4 電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀上拍照并保存結(jié)果,。

5.結(jié)果分析

本試劑盒中的陽標(biāo)大小為700 bp,。支原體陽性的PCR擴(kuò)增大小為500 bp左右。下圖為使用本試劑盒進(jìn)行檢測的結(jié)果：

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸,。-20℃ 儲(chǔ)存,，有效期為12個(gè)月。請合理分裝,，避免反復(fù)凍融,。

特別提醒

? 使用本試劑前請仔細(xì)閱讀說明書；

? 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究使用,，不得用于臨床診斷,；

? 待細(xì)胞培養(yǎng)2~3天后，細(xì)胞生長至80%匯合度（貼壁細(xì)胞）或密度達(dá)到10 6 /mL（懸浮細(xì)胞）時(shí)取樣進(jìn)行檢測,；

? 預(yù)混體系應(yīng)該在使用前化凍,，瞬時(shí)離心后，輕彈混勻,；

? 在已滅菌的PCR管中配制反應(yīng)體系,，每次實(shí)驗(yàn)均需至少加一個(gè)陰性和一個(gè)陽性對(duì)照，測試反應(yīng)管建議設(shè)置平行對(duì)照,；

? 應(yīng)該在專屬區(qū)域進(jìn)行檢測,，避免交叉污染；

? 配制過程中應(yīng)注意無菌,，戴口罩,，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染,，推薦在生物安全柜中進(jìn)行操作；

? 加液時(shí)槍頭最好貼著管壁,，所有管子用完即蓋,，需添加陽標(biāo)的各組留在最后，取過樣品的槍頭用完即棄,，盡量減少操作時(shí)污染的可能性,；

? 當(dāng)PCR反應(yīng)被強(qiáng)抑制時(shí)（即樣品+陽標(biāo)體系無法獲得陽標(biāo)條帶），建議使用PBS清洗,，同時(shí)補(bǔ)加2%BSA（需自備）后再進(jìn)行檢測,；

? 本產(chǎn)品的檢測范圍涵蓋所有支原體種類；

? 本產(chǎn)品不會(huì)檢測真核細(xì)胞和革蘭氏陰性菌的基因組DNA,，與支原體親緣較近的革蘭氏陽性菌在使用本產(chǎn)品檢測時(shí),，檢測靈敏度也會(huì)降低10000倍，進(jìn)而減少假陽性和提高特異性,；

? 檢測結(jié)果異常時(shí),，建議復(fù)檢；

? 檢測結(jié)果為弱陽性時(shí),，建議繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)7天后,，再進(jìn)行復(fù)檢。

支原體PCR檢測試劑盒