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RAW264.7+GFP 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞綠色熒光標(biāo)記

 細(xì)胞描述

此細(xì)胞株源自Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤,。sIg-, Ia-抗原,、Thy-1.2表面抗原陰性,。此細(xì)胞株不分泌可檢測到的病毒顆粒,，XC斑點(diǎn)形成試驗(yàn)陰性,。可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖,?？梢钥贵w依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞。LPS或PPD處理2天可誘導(dǎo)分解紅血球但對腫瘤靶細(xì)胞無作用,。

該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶GFP基因,。

細(xì)胞特性

1） 來源：鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤；單核細(xì)胞,；巨噬細(xì)胞

2） 形態(tài)：不規(guī)則圓形,，紡錘狀，貼壁細(xì)胞,，少量懸浮,。

3） 含量：>1x106  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用。

細(xì)胞篩選

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,，其GFP熒光強(qiáng)度會逐漸減弱。若實(shí)驗(yàn)要求需要維持熒光強(qiáng)度,，可以加入嘌呤霉素進(jìn)行再次篩選。

建議收到細(xì)胞后至少傳3代,，凍存留種后再進(jìn)行篩選,。

初次進(jìn)行細(xì)胞篩選時(shí),，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少,，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)篩選,，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/ml,。若篩選過程中,，漂浮細(xì)胞大于60%，則停止篩選,，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng),，至細(xì)胞密度約80%，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進(jìn)行篩選,。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時(shí)細(xì)胞正常增殖,，可停止篩選，用不含藥培養(yǎng)基正常培養(yǎng),。

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸,，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落,、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系,。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨,，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們,。

2）請?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）半貼細(xì)胞或貼壁不牢（懸?。┘?xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱中約2-3h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況，若細(xì)胞密度在60%以下,，客戶需收集T25瓶中的懸浮細(xì)胞離心后用培養(yǎng)基重懸后打回到原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),，若細(xì)胞生長70%-90%對細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代時(shí)需要收集培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞離心后回收,。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。 

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1） 準(zhǔn)備DMEM(包含2mM L-谷氨酰胺,，0.11g / L丙酮酸鈉)培養(yǎng)基,；優(yōu)質(zhì)胎牛血清10 %；P/S青霉素-鏈霉素 1%,。

2） 注意事項(xiàng)：

（a）在細(xì)胞生長的初始階段,，細(xì)胞以貼壁的形式生長并呈現(xiàn)出長方體的形態(tài)和有“偽足"延伸。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,，細(xì)胞呈現(xiàn)圓形并以疊加的形式生長,。細(xì)胞密度達(dá)到一定的程度，會有細(xì)胞以懸浮的方式散落到到培養(yǎng)基中,，鏡下觀察會發(fā)現(xiàn)懸浮和貼壁的細(xì)胞會同時(shí)出現(xiàn),。

（b）該細(xì)胞傳代時(shí)不需要用胰酶消化。傳代時(shí),，用無菌細(xì)胞刮刮拭培養(yǎng)表面將細(xì)胞刮落,，收集離心后重懸接種到新的培養(yǎng)瓶中。（c）該細(xì)胞形態(tài)上包含松散貼壁的紡錘形和圓形或者立方形,。當(dāng)細(xì)胞密度較大時(shí),，細(xì)胞會輕微脫落變圓或者許多細(xì)胞堆積在一起，有些細(xì)胞甚至脫落漂浮,。這些漂浮的細(xì)胞是存活的,，在傳代時(shí)應(yīng)收集起來，離心后細(xì)胞沉淀可以繼續(xù)培養(yǎng),。

（d）血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞貼壁能力變化,，應(yīng)選用高質(zhì)量的胎牛血清。

3） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣,，95%,；二氧化碳，5%,。 溫度：37攝氏度,，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

4） 凍存液：90%血清,，10%DMSO,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液,，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

該細(xì)胞為懸浮和輕微的貼壁細(xì)胞,，傳代可以參考以下方法：

該細(xì)胞用細(xì)胞刮鏟替代胰酶來對細(xì)胞進(jìn)行處理,。用無菌細(xì)胞刮鏟刮拭細(xì)胞附著培養(yǎng)表面將細(xì)胞刮落，收集細(xì)胞后離心去上清,，重懸后接種到新的裝有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi),。收貨后第一次傳代1:2進(jìn)行，后續(xù)可以根據(jù)實(shí)際的情況以1:2~1:4的比例進(jìn)行傳代,。

3） 細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用,。

 RAW264.7+GFP 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞綠色熒光標(biāo)記