NGS方法已被廣泛用于檢測大多數(shù)序列變異,。然而,，這些方法無法準確解析基因組中復雜的重復或高GC含量區(qū)域。這使得結(jié)構(gòu)變異的檢測尤其具有挑戰(zhàn)性,。利用Bionano 光學基因組圖譜技術(shù) (Optical genome mapping,OGM),，可以在高靈敏度下以無偏、全基因組的方式檢測結(jié)構(gòu)變體,。這項革命性的技術(shù)揭示了傳統(tǒng)測序和細胞遺傳學分析之前的“盲點",；然而，它需要分離超高分子量（UHMW）DNA,。超長分子的長度通常在250 kbp以上甚至超過1 Mbp,，傳統(tǒng)的提取方法很難完整獲取。為了應(yīng)對這一技術(shù)挑戰(zhàn),，Hamilton與Bionano Genomics合作開發(fā)了提供超高分子量DNA提取的自動化解決方案-Long String VANTAGE. 這使得基因組DNA提取過程中大大減少了碎片的產(chǎn)生,。從這一自動化過程中提取的超高分子量DNA進而被標記，并為光學基因組作圖（OGM）分析生成高質(zhì)量數(shù)據(jù),。
在不斷發(fā)展的基因組研究領(lǐng)域,，技術(shù)創(chuàng)新為深入了解以前尚未解決的基因組生物學問題提供了機會。超長DNA分子的繪圖改變了我們看待基因組的方式,，對其結(jié)構(gòu)的分辨率達到了很高的水平,。Hamilton提供超高分子量DNA提取的自動化解決方案-Long String Vantage. 利用這種高效、省時的樣本處理解決方案,，可以更高通量的實現(xiàn)光學基因組作圖（OGM）,。
方法描述
該方法基于 Bionano Prep SP 冷凍細胞沉淀 DNA 提取方法,，并對自動化過程進行了優(yōu)化。簡言之,，將約100萬個細胞的冷凍 HL-60 細胞沉淀手動重懸于含有 RNase A 的 DNA 穩(wěn)定緩沖液中,，并放置在96深孔板中。后續(xù)步驟將在Long String VANTAGE 儀器上自動化執(zhí)行,。
細胞裂解和蛋白酶 K消化將在特制緩沖液中進行,。隨后通過加入 PMSF 終止該過程。通過加入異丙醇將 UHMW DNA 結(jié)合到 Bionano Prep SP Disk上,。隨后進行3個洗滌步驟,，從結(jié)合的DNA中去除雜質(zhì)。對于最終洗脫,，將Disk轉(zhuǎn)移至微孔板頂部的預(yù)填充洗脫緩沖液條中,。
最后，用戶可以在臺面外進行離心步驟,，將最終洗脫液留在微孔板中,，將Disk保留在 Hamilton 洗脫條中。該過程獲得了適用于 Bionano Genomics 下游直接標記和染色 (DLS) 過程的 UHMW DNA 提取物,。該過程基于酶法進行基因組特異性標記,，最終可在Bionano Genomics Saphyr ®系統(tǒng)上收集數(shù)據(jù)。
系統(tǒng)描述
Long String VANTAGE 是一種即用型工作站,，具有標準化硬件配置,，適用于自動化magnetic disk或磁珠處理工作流程。本品僅適用于研究用途 (RUO),。其基于Microlab ®VANTAGE平臺,，具有4個1 mL CO-RE ®移液通道以及4個用于disk處理步驟的5 mL CO-RE®通道。
應(yīng)用軟件
Long String VANTAGE VENUS框架是專門為該方法而設(shè)計和開發(fā)的,。
試劑盒描述
Bionano 的 SP 血液和細胞培養(yǎng) DNA 分離試劑盒 (80042) 是在Long String VANTAGE 上開發(fā)UHMW DNA 提取自動化工作流程的基礎(chǔ),。該方法通過簡單的裂解、結(jié)合,、洗滌和洗脫流程來獲得UHMW DNA,。該試劑盒使用的是由納米結(jié)構(gòu)二氧化硅表面覆蓋的順磁盤,，而不是磁珠或硅基離心柱,。這提供了高 DNA 結(jié)合能力，并有助于保護結(jié)合的 DNA 免受剪切力破壞,?；厥盏?UHMW DNA 大小通常在 250 kbp 至 > 1 Mbp之間，濃度范圍為50-120 ng/µL,。
可視化流程
使用人白血病細胞系HL-60細胞沉淀測試自動化方案,。
HL-60細胞（DMSZ,，ACC3）在DMEM+10%FBS和雙抗培養(yǎng)基中于37°C，含5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng),。通過離心收集細胞,，并在使用前作為1.5 M HL-6細胞的細胞沉淀在-80°C下冷凍存儲。在實驗當天,，將細胞沉淀在37°C下解凍30秒,，并通過手動移液將其重懸于40μL DSB/RNase Cocktail混合液中。將得到的細胞懸浮液合并,，將對應(yīng)于100萬個細胞的體積轉(zhuǎn)移到96深孔板的單個孔中,，并提供給Long String VANTAGE。在對層疊在洗脫板頂部的條帶進行裂解和消化,、結(jié)合,、洗滌和Disk轉(zhuǎn)移后，在室溫下以2200 rcf對洗脫板組件進行離心1分鐘,。
該方法成功的得到驗證,，每次可處理12個樣品。使用相同參數(shù)共進行了4次驗證試驗（3次試驗,，4個樣品,，1次試驗，12個樣品）,。
在Long String VANTAGE上洗脫UHMW DNA后,，使用標準200μL吸頭將樣品剪切4次，然后在Hula混合器上進行1小時顛倒混勻,，并在室溫下孵育過夜,。根據(jù)說明書，使用Qubit dsDNA BR檢測試劑盒對UHMW DNA進行定量,。然后使用Bionano Prep直接標記和染色（DLS）方案的優(yōu)化版本標記DNA,。根據(jù)系統(tǒng)用戶指南，使用Qubit 1X dsDNA HS檢測試劑盒對標記的DNA進行定量,，并將其加載到Bionano芯片上,，在Saphyr儀器上運行。收集所有樣品大于150kbp分子的400Gbp光學數(shù)據(jù),。
技術(shù)
Hamilton專有的磁棒技術(shù)確保了最佳的Magnetic Disk處理,。Paramagnetic Disk可通過5ml移液通道直接操作，無需額外的臺面設(shè)備,?？烧{(diào)參數(shù)設(shè)置確保最佳實驗結(jié)果。
Hamilton Magrod套筒以最高的精度制造，并根據(jù)可能的最佳Magnetic Disk定位進行塑形,。匹配可保護Magrod免受周圍液體和試劑的影響,。Hamilton洗脫條用于通過離心從最終UHMW DNA樣品中分離Magnetic Disk。Disk保留在條帶中,，而洗脫液被吸入微量滴定板,。
結(jié)果
自動化過程獲得的結(jié)果表明，樣品產(chǎn)率是可重復的,，并符合Bionano Prep SP冷凍細胞沉淀DNA分離方案（圖A,，藍條）中規(guī)定的手動提取的預(yù)期值。
DLS標記后進行額外的樣品濃度測量,，以確保有足夠的產(chǎn)量用于進一步處理（圖A,，灰點）。數(shù)據(jù)表明,，對于在Long String VANTAGE上分離的所有樣品,，都回收和體現(xiàn)了合適量的產(chǎn)物DNA。
在Saphyr儀器上運行的樣本數(shù)據(jù)分析表明,，分子長度超過了Bionano Genomics提供的閾值,，并證明存在大于230 kbp的超高分子量DNA（圖B）。從Hamilton Long String VANTAGE分離的DNA包含Mbp長度的分子,，在提取,、標記、線性化和成像后,，其總體上超過了230 kbp的OGM質(zhì)量閾值,。
從Saphyr儀器收集的數(shù)據(jù)中得出了進一步的質(zhì)量控制指標（下圖）。所有樣本在特異性和靈敏度范圍內(nèi)均顯示出一致的標記性能（下圖A,、B）,。Map率超過了Bionano Genomics提供的質(zhì)量指標閾值（下圖C）。
Long String VANTAGE可在一個工作日（8小時）內(nèi)處理多達12個樣品,。這比手動方法的效率顯著增加,，建議每次運行6個樣本。
結(jié)論
作為精密自動化液體處理的專家和對基因組工作流程的關(guān)注,，Hamilton正在進入這個應(yīng)用領(lǐng)域,。我們與Bionano Genomics合作，建立了超高分子量DNA提取自動化解決方案,。結(jié)合光學基因組作圖,，Long String VANTAGE將能夠以從樣本中標準化且可重復地提取超高分子量DNA，賦能您的基因研究,。
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