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圖片來(lái)源：7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE

實(shí)驗(yàn)設(shè)置：

a.實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)

b.儀器型號(hào)

c.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾俊enotyping(基因分型),、定性（有/無(wú)）

d.定量類(lèi)型：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、相對(duì)定量

e.實(shí)驗(yàn)方法：探針?lè)?、染料?/p>

f.模板類(lèi)型：gDNA,、cDNA

g.Target設(shè)置：Target包括目的基因、內(nèi)參基因（多少個(gè)和名稱(chēng)）,。

探針?lè)ㄐ枰x擇使用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),。

h.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)設(shè)定：幾個(gè)點(diǎn)、每點(diǎn)幾個(gè)重復(fù),、定義標(biāo)準(zhǔn)量范圍,。

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i.樣本設(shè)置：Sample包括實(shí)驗(yàn)組,、對(duì)照組,、負(fù)對(duì)照組；樣本數(shù),、每樣本重復(fù)數(shù)、陰性對(duì)照數(shù),、樣本選擇和命名,。

j.反應(yīng)孔的設(shè)置：根據(jù)樣品的排布選中面板上的加樣孔,，勾選左邊對(duì)應(yīng)的目的基因及模板。

注意：不應(yīng)為了方便將所有孔選成同一個(gè)Target同一個(gè)Sample,，這樣排布會(huì)造成比較大的風(fēng)險(xiǎn),。我們通過(guò)下面的例子進(jìn)行說(shuō)明：

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我們同一塊板上同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)基因,，而布孔時(shí)選成同一個(gè)Target,，那么儀器默認(rèn)的都是同一個(gè)閾值，假如布孔時(shí)都選成Target1,，紅色這條閾值線(xiàn)對(duì)于Target1是合理的,，但對(duì)于Target2則不合理，因?yàn)檫@時(shí)已經(jīng)不在指數(shù)擴(kuò)增期,，得到的Ct值并不可信,。

反應(yīng)程序設(shè)置：PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的Master Mix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分鐘）,。

a.反應(yīng)體系設(shè)置：

反應(yīng)體系的配制,，不得不說(shuō)到參比／校正染料（reference dye，passive dye）,。常用的是ROX或者其他染料,，只要不影響檢測(cè)PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。

參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定量反應(yīng)中的非PCR震蕩,，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差,，提供一個(gè)穩(wěn)定的基線(xiàn)。現(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROX配制在MasterMix或者Premixture里,，也有的是單獨(dú)分開(kāi),。如果反應(yīng)曲線(xiàn)良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROX染料校正,。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要,。

需要注意一點(diǎn)ABI儀器的需要加ROX參比染料的，默認(rèn)的是ROX,，要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個(gè)步驟的選擇,。如BioTeke的MasterMix里沒(méi)有參比染料，所以選擇“none",。

b.兩步法或三步法：qPCR反應(yīng)可以將退火與延伸兩步進(jìn)行合并,，條件需要根據(jù)引物和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整，根據(jù)qPCR引物設(shè)計(jì)原則,，引物的Tm值在60℃左右,，因此這一步的溫度一般可設(shè)為60℃。

c.熒光信號(hào)采集：對(duì)于染料法而言,，兩步法檢測(cè)的熒光信號(hào)采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟,；三步法應(yīng)當(dāng)在72℃延伸時(shí)采集,，此時(shí)絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài)；Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào),。以ABI 7500為例,，選擇在哪一步采集熒光信號(hào)點(diǎn)亮其下面的小方塊即可。

d.熔解程序：使用染料法進(jìn)行熒光定量PCR時(shí),，我們通常會(huì)在擴(kuò)增階段完成后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析,，幫助確定產(chǎn)物類(lèi)型，判斷是否有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生,。

以SYBR Green法為例,，SYBR Green染料只有結(jié)合到雙鏈DNA的小溝中才能發(fā)出熒光，擴(kuò)增反應(yīng)完成后,，對(duì)產(chǎn)物逐漸升溫同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào),，隨著溫度升高，DNA雙鏈解開(kāi),，產(chǎn)物熒光信號(hào)下降,。

溶解曲線(xiàn)程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說(shuō)明書(shū)上建議的程序,。溫度一般設(shè)置在60℃-95℃區(qū)間，能包含產(chǎn)物Tm值和非特異產(chǎn)物Tm值即可,。在某個(gè)溫度下,，雙鏈DNA會(huì)解鏈一半，此后剩下的一半會(huì)迅速解鏈,，熒光驟降并形成變化的拐點(diǎn),，這個(gè)溫度稱(chēng)為退火溫度（Tm值）。將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)作圖(-dI/dT),，從而生成熔解曲線(xiàn),。

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RUN：全部設(shè)置好之后,，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器,，點(diǎn)擊RUN！

數(shù)據(jù)分析：

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