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乳酸脫氫酶（LDH）釋放法
1）測定方法 1．用含5％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將靶細(xì)胞調(diào)整到5×104～2×105/ml，此濃度需根據(jù)情況預(yù)先標(biāo)定,。 2．在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞,，每孔加100μl。3個(gè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對照孔不加靶細(xì)胞,，只加100μl培養(yǎng)液,。 3．向各孔加100μl效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例根據(jù)要求而定,，通常為5：1～20：1,。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加100μl培養(yǎng)液，最大釋放孔中加100μl 1％ NP40,。每個(gè)實(shí)驗(yàn)置三個(gè)復(fù)孔,。 4．置37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6小時(shí)。 5．離心培養(yǎng)板200×g 10分鐘,。每孔吸出150μl上清液,，對應(yīng)加入另一塊96孔酶聯(lián)檢測板中。向第二塊板每孔依次加20μl 0.4mol/L乳酸溶液,、20μl 4mmol/L 2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑,，20μl反應(yīng)液（含0.03％ BSA，2.7U/ml硫辛酰胺脫氫酶,，4.5mmol/L氫化型輔酶I（NAD＋）,，1.2％蔗糖的PBS），室溫中放置20分鐘,。 6．在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的光密度（OD值）,，檢測波長492nm，參考波長650nm,。 2）特異性殺傷活性的計(jì)算 殺傷活性（％）＝[（OD實(shí)驗(yàn)組－OD總自然釋放）/（OD最大釋放組－OD總自然釋放）]×100％ |