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樹舌靈芝深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究
今天喆圖小編就來說說樹舌靈芝又稱樹舌扁靈芝,，屬于真菌門,、擔(dān)子菌亞門、層菌綱,、非菌褶目,、靈芝菌科、靈芝屬,。樹舌具有廣泛的藥理活性,，民間用其治療食道癌、肺結(jié)核,，臨床用于治療腹水癌,、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝炎,、心臟病,、糖尿病和糖尿病并發(fā)癥，預(yù)防和治療胃潰瘍,、急慢性胃炎,、十二指腸潰瘍、胃酸過多等胃病,。另外研究表明,，樹舌三萜類物質(zhì)具有血壓雙向調(diào)節(jié)、抗腫瘤,、抗病毒等藥理活性,。目前國內(nèi)對樹舌靈芝的化學(xué)成分和藥理學(xué)研究得比較多，但對樹舌靈芝深層發(fā)酵方面的研究較少,。深層發(fā)酵培養(yǎng)樹舌菌絲體具有發(fā)酵周期短,、工藝簡單、易控制,、適于工業(yè)化大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),。本試驗(yàn)應(yīng)用高氯酸——香草醛顯色法來測定樹舌靈芝發(fā)酵菌絲總?cè)祁惢衔锖浚钥側(cè)飘a(chǎn)量為基準(zhǔn),，篩選出樹舌靈芝深層發(fā)酵的適培養(yǎng)基,。
通過單因素試驗(yàn)，確定樹舌靈芝的適宜氮源為豆餅粉,，適宜碳源為米糠和蔗糖,；在此基礎(chǔ)上,，以篩選的碳源、氮源和無機(jī)鹽KH2PO4 和MgSO4·7H2O為考察因素,，以總?cè)飘a(chǎn)量為主要指標(biāo)利用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方比例，確定樹舌靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：米糠4%,、蔗糖1%,、豆餅粉4%、KH2PO4 0.2%,、MgSO4·7H2O 0.05%,。
一、 （材料和儀器 ）
1,、實(shí)驗(yàn)所需材料 硝酸銨,、硫酸銨、氯化銨,、硝酸鉀,、蛋白胨、酵母膏,、葡萄糖,、蔗糖、可溶性淀粉,、磷酸氫二鉀,、硫酸鎂、高氯酸,、冰醋酸,、香草醛均為分析純；齊墩果酸對照品,，中國藥品生物制品檢定所,；豆餅粉、玉米粉,、麥芽粉,、甘薯粉、米糠和麩皮均為提取液,，煮沸0.5h后用紗布過濾制得,。
2、實(shí)驗(yàn)用主要儀器設(shè)備
鼓風(fēng)干燥箱,，立式高壓滅菌鍋,，電子天平，紫外分光光度計(jì),，恒溫水浴鍋,，恒溫?fù)u床,，恒溫培養(yǎng)箱。
二,、（實(shí)驗(yàn)方法 ：基本培養(yǎng)基）
1.1 斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基為土豆20%,，葡萄糖2%，瓊脂2%,，pH自然,。接一塊綠豆粒菌塊接種于PDA培養(yǎng)基的中央，放入恒溫培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)7天,。
1.2 液體培養(yǎng)基 玉米粉1%,，蔗糖2%，蛋白胨0.5%,，KH2PO4 0.1%,，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然,。
1.3 氮源篩選培養(yǎng)基 葡萄糖2%,，可溶性淀粉1%，KH2PO4 0.1%,，MgSO4·7H2O 0.05%,，PH自然。分別以豆餅粉,、麩皮,、蛋白胨、酵母膏,、硫酸銨,、硝酸銨、氯化銨,、硝酸鉀為氮源,，添加量為2%。
1.4 碳源篩選培養(yǎng)基 麩皮2%,，KH2PO4 0.1%,，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然,。分別以葡萄糖,、蔗糖、可溶性淀粉,、玉米粉,、麥芽粉、甘薯粉,、米糠等為碳源,，添加量為3%,。
培養(yǎng)方法
2.1 種子液制備 將斜面菌種分割成黃豆大小，接種到液體培養(yǎng)基中,，250mL三角瓶裝液量100mL,，于恒溫?fù)u床中25℃，120r/min振蕩培養(yǎng)10d得一級種,。將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種以體積分?jǐn)?shù)10%接種到同樣液體培養(yǎng)基中,，500mL三角瓶裝液量200mL，在與一級種同樣條件下培養(yǎng)7d得種子液備用,。
2.2 培養(yǎng)基篩選 將制備好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量接種到不同的碳氮源培養(yǎng)基及正交試驗(yàn)篩選培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量100mL,，于恒溫?fù)u床中25℃,，120r/min振蕩培養(yǎng)7d后收集菌絲體。分析不同碳源,、氮源對菌絲體生物量和三萜總量的影響,。每次試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值,。
2.3 混合碳氮源培養(yǎng)基正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果,，并考慮到低投入高產(chǎn)出的原則，選用米糠和蔗糖作為復(fù)合碳源,，豆餅粉作為氮源,，磷酸二氫鉀和硫酸鎂作為無機(jī)鹽，按L9（34）設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn),，9個(gè)組合,，4次重復(fù)，優(yōu)化培養(yǎng)基,。
2.4 發(fā)酵菌絲體生物量測定 采用細(xì)胞干重法,，取100ml發(fā)酵液，用100目紗網(wǎng)過濾得菌絲體,，并用蒸餾水反復(fù)沖洗,，至濾出液澄清為止，收集菌絲體,，于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重,，稱重。
三,、（三萜含量測定）
3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備（200μg/ml齊墩果酸） 稱取干燥至恒重的齊墩果酸20mg,，置于100ml的容量瓶中加無水乙醇溶解，并定容至刻度,，作為對照品溶液,。
3.2 樣品溶液的制備 取樣品0.5g（到萬分之一）,，加入10ml無水乙醇，超聲波提取30min后,，搖勻,，過濾，取濾液,，定容至50mL,，即得樣品溶液。用分光光度法測定樣品中靈芝三萜物質(zhì)含量,。
3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2,、0.4、0.6,、0.8,、1.0、1.2mL, 于6只具塞磨口試管中,。加5%香草醛-冰醋酸液0.4mL,，搖勻。再加入0.6mL高氯酸,，置于60℃恒溫水浴鍋中20 min,，冰浴冷卻后，加冰醋酸5.0 mL,，搖勻,，置于室溫15 min后，按分光光度法（《中國藥典》2005版 I部附錄VA）,，以試劑為空白,，在545nm處比色測定吸光度值。以齊墩果酸濃度（?g/ml） 為橫坐標(biāo),，吸光度A為縱坐標(biāo),，作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.4 樣品的測定 吸取1ml樣品溶液,，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光度,。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總?cè)扑崽崛∥镔|(zhì)量。
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