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菌種培養(yǎng)
在自然界里，食用菌都不是單獨(dú)存在的,，而是和許多細(xì)菌,、放射菌、霉菌等生活在一起的,。所謂菌種分離,，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來(lái),，通過(guò)培養(yǎng),，獲得純的優(yōu)良菌種。菌種分母種,、原種,、栽培種。
(一）母種的分離培養(yǎng) 食用菌母種的分離,，可分為孢子分離法,、組織分離法以及基內(nèi)菌絲分離等。 1.孢子分離法 孢子分離法,，是用食用菌的有性孢子或無(wú)性孢子萌發(fā)成菌絲,，培養(yǎng)成菌種的方法。這種菌種生活力較強(qiáng),，但孢子個(gè)體之間有差異,，且自然分化現(xiàn)象較嚴(yán)重，變異大,，需經(jīng)出菇試驗(yàn)才能在生產(chǎn)上應(yīng)用,。
（l）單孢分離法：是每次或每支試管只取一個(gè)擔(dān)孢子,， 讓它萌發(fā)成菌絲體來(lái)獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲,，有結(jié)實(shí)能力,，可采用此法分離生產(chǎn)純菌種。單孢分離生產(chǎn)上較少采用,，而且技術(shù)復(fù)雜,，一般采用多孢分離法。
（2）多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養(yǎng)基上,，讓它們萌發(fā),、自由交配來(lái)獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法,，有以下幾種： ① 種菇孢子彈射法：選擇個(gè)體健壯,、朵形圓正，無(wú)病蟲(chóng)害,、出菇均勻,、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)的八九分成熟的種菇,，切去大部分,，菌柄用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍后再用已滅菌的 紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分,。在接種箱或無(wú)菌室內(nèi),，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養(yǎng)皿上面,；上端小孔用棉花塞住,。培養(yǎng)皿放 在一個(gè)鋪有紗布的搪瓷盤(pán)上，靜置12～20小時(shí),，菌褶上的孢子就會(huì)散落在培養(yǎng)皿內(nèi),。形成一層粉末狀孢子印（平菇極淡紫色,，蘑菇,、草菇 為褐色，香菇,、金針菇孢子印白色）,。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養(yǎng)皿上劃線接種。待孢子萌發(fā),，生成菌落時(shí),，選孢子萌發(fā)早、長(zhǎng)勢(shì)好的菌落進(jìn)行試管培養(yǎng)。 還可用孢子采集器收集孢子,。方法是選好種菇后,，按上述程序，輕輕掀開(kāi)玻璃鐘罩,，將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼絲架上,，放在培養(yǎng)皿正中央。隨即蓋好玻璃罩,，用紗布將鐘掌周?chē)?。并在紗布上倒少許 HgCl2或無(wú)菌水。移入 20℃左右恒溫培養(yǎng)箱,。 ②褶上涂抹法：按無(wú)菌操作分離時(shí),；應(yīng)選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間,，輕輕抹取褶片表面子實(shí)體尚未彈射的孢子,，再在培養(yǎng)基上劃線接種。 ③鉤懸法：取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片（黑木耳,、毛木耳,、白木耳〕，用無(wú)菌不銹鋼絲（或鐵絲,、棉線等其他懸掛材料）懸掛于三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基的上方,，勿使接觸到培養(yǎng)基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養(yǎng),、轉(zhuǎn)接即可,。 ④貼附法：按無(wú)菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊， 用溶化的瓊脂培養(yǎng)基或阿拉伯膠,、漿糊等貼附在配管斜面培養(yǎng)基正上方的試管壁上,。經(jīng)6～12小時(shí)的培養(yǎng)，待孢子落在斜面上,，立即把孢子連同部分瓊脂培養(yǎng)基移植到新的試管中培養(yǎng)即可,。 孢子分離得到的母種、必須進(jìn)一步提純復(fù)壯,，當(dāng)母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時(shí),，選擇菌絲健壯,、生長(zhǎng)旺盛無(wú)老化、無(wú)感染雜茵的母種試管,，進(jìn)而轉(zhuǎn)管擴(kuò)大,，一般到栽培種，轉(zhuǎn)管不宜超過(guò)5次。 孢子分離得到的母種,，必須通過(guò)出菇試驗(yàn),，鑒定為菌種后，才可供生產(chǎn)使用,。 一般菌類如蘑菇,、平菇、鳳尾菇,、香菇,、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種,。 現(xiàn)就銀耳孢子分離略述于下： 按 無(wú)菌操作獲取種耳后,，懸掛種耳的三角瓶經(jīng)12小時(shí)培養(yǎng)后，瓶底培養(yǎng)基表面就有"孢子印",。取出種耳,，置 20℃—25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天，培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)乳白色透明的糊狀小菌落,，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲,。此時(shí)移接入試管斜面培養(yǎng)基上， 待長(zhǎng)滿斜面后,，再移接入營(yíng)養(yǎng)豐富,，且表面比較干燥的培養(yǎng)基上。經(jīng)30天左右,，菌落長(zhǎng)出白色菌絲,。 銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌（香灰菌絲）混合培養(yǎng)時(shí),，由后者幫助分解木材及其他一些纖維物質(zhì),，提供營(yíng)養(yǎng)，才能利于銀耳孢子萌發(fā),，菌絲的定植和子實(shí)體的形成,。
在兩種菌絲交會(huì)時(shí)，先選出兩種純菌絲,。 羽毛狀菌絲要純化選育,，一般要選取生長(zhǎng)迅速，爬壁力強(qiáng)的試管斜面或種瓶,，取先端菌絲,，轉(zhuǎn)管移接，置25℃—28℃上培養(yǎng),，重復(fù)轉(zhuǎn)管幾次即可得到優(yōu)良純種,。 銀耳菌絲的特點(diǎn),，菌絲生長(zhǎng)緩慢，擔(dān)孢子也不易萌發(fā),。在進(jìn)行兩菌混合時(shí),，先取經(jīng)8～I(xiàn)O天培養(yǎng)的銀耳菌絲斜面，按無(wú)菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5厘米處接入一 小塊羽毛狀菌絲,。置25℃下培養(yǎng)1周即得到混合好的銀耳母種,。 2．組織分離培養(yǎng)法 利用子實(shí)體內(nèi)部組織，進(jìn)行無(wú)性繁殖而獲得母種的簡(jiǎn)便方法,，即組織分離,。該法操作簡(jiǎn)便，菌絲生長(zhǎng)發(fā)育快,，品種特性易保存下來(lái),，特別是雜交育種后，優(yōu)良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩(wěn)定下來(lái),。
常采用以下分離方法,。
（l） 子實(shí)體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短,，八九分成熟的優(yōu)良品種,。切去菇兩基部，在無(wú)菌箱內(nèi)以0.1％的 HgCl2水浸幾分鐘,，再用無(wú)菌水沖洗并揩干或用75％酒精 棉球擦拭菌蓋與菌柄2次,，進(jìn)行表面消毒。接種時(shí),，只要將種菇撕開(kāi),，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織,；移接 到PDA培養(yǎng)基上,。置25℃左右溫度下培養(yǎng)3-5天，就可以看到組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲,，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大即得到菌種,。如香菇、平菇等可以用此方法,。
（2） 菌核分離：茯苓,、豬苓、雷丸等菌的子實(shí)體不易采集,。而常見(jiàn)的是它貯藏營(yíng)養(yǎng)的菌核,。用菌核分離，同樣可以獲得菌種,。方法是將菌核表面洗凈,，用酒精或 HgCl2消毒 后，切開(kāi)菌核,，取中間組織一小塊,，約黃豆大小，接種在PDA 培養(yǎng)基斜面上,，保溫培養(yǎng),。應(yīng)注意的是，菌核是貯藏器官,，大部分是多糖類物質(zhì),，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些,，如果組織塊過(guò)小,，則不易分出菌種。
（3）菌素分離：有一部分子實(shí)體不易找到,，也沒(méi)有菌核,，可以用菌素進(jìn)行分離。如蜜環(huán)菌,、假蜜環(huán)菌,。其操作方法是先用酒精或 HgCl2將菌素表面黑 色皮層輕輕擦拭2～3次， 然后去掉黑色外皮層（菌鞘）,，抽出白色菌髓部分,；用無(wú)菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養(yǎng)基上,，保溫培養(yǎng),，即得該菌菌種。 菌素分離要注意：因菌素比較細(xì)小,，分離素也比較細(xì)小,，分離時(shí)極易污染雜菌，所以要嚴(yán)格操作,。 3．基內(nèi)菌絲分離培養(yǎng)法 利用食用菌生育的基質(zhì)作為分離材料,，來(lái)得到純菌種的一種方法，叫基內(nèi)菌絲分離法,。 此種分離方法是適宜只有在特定的季節(jié)才出現(xiàn),，而且是朝生暮死，不易采得的子實(shí)體,?；鶅?nèi)分離法與組織分離法不同之點(diǎn)是，干燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀 態(tài),。接種后有時(shí)并不立刻恢復(fù)生長(zhǎng),。因此,，有必要保留較長(zhǎng)的時(shí)間（約1個(gè)月），以斷定菌絲是否能成活,?；鶅?nèi)菌絲分離法又可分為，材中菌絲分離（即菇木或耳木 分離法）及土中菌絲分離法等,。
（1）材中菌絲分離法：就是菇木或耳木分離法,，為了減少雜菌的感染，菇（耳）木在分離之前,，必須進(jìn)行無(wú)菌處理,。可 以把菇（耳）水表面用酒精燈火焰輕輕燒過(guò),，以燒死霉菌的孢子,，或再用0.1％的 HgCl2水浸孢幾分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗后用無(wú)菌濾紙吸干,。接種塊切取時(shí)應(yīng)注意,。接種塊必須在該菌菌絲分布的范圍內(nèi)切取。所以,，菌絲生長(zhǎng)緩慢的種類應(yīng)淺?。痪N生長(zhǎng)快的種類可以深取,。同時(shí),。還應(yīng)根據(jù)菇菌的種類、木材質(zhì)地,、菇（耳）木粗細(xì),、發(fā)育時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)確定菌絲分布的范圍。然后用一把利刀進(jìn)行切取,。接種塊應(yīng)盡量小些,，以減少雜菌感染機(jī)會(huì)，提離菌種的純度,。接種塊移到培養(yǎng)基上,，就 應(yīng)該放到適合菌絲生長(zhǎng)的22℃～26℃ 的溫室或溫箱中培養(yǎng)，使菌絲恢復(fù)生長(zhǎng),。
（2）土中菌絲分離：食用菌種類很多,，許多土生的食用菌；孢子不易萌發(fā),。組織分離也不易成功,，用土中菌絲分離獲得純種的方法，叫土中菌絲分離,。 土 中菌絲分離時(shí)要注意,，由于土中菌絲體的周?chē)钪喾N多樣的土壤微生物,，因此分離時(shí)必須盡可能避開(kāi)這些微生物的干擾，盡可能批取清潔菌絲素的,、不帶雜 物的菌絲接種,，反復(fù)用無(wú)菌水沖洗,，在培養(yǎng)基中加入一些抑制細(xì)菌 生長(zhǎng)的藥物,，如40微克／升的鏈霉素或金霉素。如發(fā)現(xiàn)感染細(xì)菌,，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來(lái),，接種到木屑培養(yǎng)基中。因細(xì)菌沒(méi)有分解木質(zhì)素的能力,，因此在木屑培養(yǎng)基中不易擴(kuò)展,；只局限于接種處。待菌絲長(zhǎng)出感染區(qū)后,，就可以再進(jìn)行擴(kuò)大提純了,。
（3）子實(shí)體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實(shí)體基部分離出新菌絲的方法,，叫子實(shí)體基部分離,，現(xiàn)以袋栽銀耳為例說(shuō)明：從出耳早、出耳率離,、無(wú)病蟲(chóng)害的栽培室中,；選擇生活力頑強(qiáng)的幼耳5袋，移到氣候溫和,，有散射光的野外場(chǎng)所進(jìn)行后期培養(yǎng),，以增強(qiáng)菌絲體的生活力。經(jīng)培養(yǎng) 7～10天后,，待子實(shí)體直徑達(dá)4～5厘米時(shí)便可取回,，作為分離的母體。再?gòu)闹泻Y選理想的一朵,，用利刀割掉銀耳子實(shí)體,，放置于 0℃的冰箱或有C6H6O4S的容器中過(guò)夜，以便殺死瓶中的害蟲(chóng),。然后用75％酒精或HgCl2擦洗耳基和袋子外邊的雜質(zhì),，連同接種工具、接種培養(yǎng)基等移進(jìn)無(wú)菌室,。經(jīng)滅菌后,，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，并進(jìn)行培養(yǎng),。待袋口露出白色菌絲時(shí),，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結(jié)體,，迅速移入母種試管培養(yǎng)基 的中央，輕輕地脫去接種針,， 塞上棉塞,。 為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管,，以便從中選擇,。分離后應(yīng)及時(shí)移入22℃—24℃恒溫箱或溫室中培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基內(nèi)水分較 多,，菌絲恢復(fù)要比耳木分離得快,。經(jīng)2-3天后，分離物的邊緣就可看 到白色菌絲,。每天要至少觀察兩次,，以便提純。觀察,、提純方法與耳木分離法擔(dān)同,。經(jīng)適溫培養(yǎng)10-15天后，當(dāng)接種塊扭結(jié)團(tuán)出現(xiàn)紅,、黃色水珠時(shí),，即可擴(kuò)大原種。
(二)原種和栽培種的接種培養(yǎng)
母種獲得以后,為了滿足菌種生產(chǎn)的需要,。應(yīng)選出優(yōu)良,、純度高的母種進(jìn)一步擴(kuò)大為原種。 原種培養(yǎng)基一般采用棉籽殼,、木屑,、草類等培養(yǎng)基。
瓶裝或袋裝的原種培養(yǎng)基滅菌后,，可送入滅過(guò)菌的接種箱內(nèi),，待瓶中的培養(yǎng)基冷至30℃以下，可按照無(wú)菌操作程序進(jìn)行接種,。 菌種瓶（袋）放入培養(yǎng)室時(shí),，要經(jīng)常進(jìn)行檢查，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)雜菌污染,，立即取出,。培養(yǎng)成的原種，菌絲體必須健壯有力,，緊貼瓶壁而不干縮,，顏色純正，具有一定清香味，生活力強(qiáng),，擴(kuò)制成栽培種時(shí)吃料快,。 栽培種就是將原種進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)成三級(jí)種，它和原種的接種及培養(yǎng)相同,。一般香菇,、平菇、冬菇,、猴頭,、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木,、棉皮作培養(yǎng)基,。蘑菇多用糞草做培養(yǎng)料。 栽培種要求料塊不脫水干縮,。菌絲體健壯有力、顏色純正,，有清香味,，無(wú)老化現(xiàn)象，無(wú)雜菌污染,，有的種許可有少量原基,，接入栽培料后，發(fā)菌快,，長(zhǎng)勢(shì)好,，生活力強(qiáng)。原種在接栽培種時(shí),，原種瓶口的一層菌絲體應(yīng)挖去不用,。
（三）液體種的簡(jiǎn)單培養(yǎng) 目前，用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)菌種,，具有生產(chǎn)量大,、周期短、菌齡整齊,、成本低廉,、接種方便等特點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)食用菌工廠化生產(chǎn)的目標(biāo)?，F(xiàn)將液體種培育過(guò)程簡(jiǎn)述于后,，供參考。 簡(jiǎn)言之就是將純正優(yōu)良的菌種,，接入液體培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基不加凝固劑）,，使菌絲繁殖形成大量小菌球，然后將這種培養(yǎng)基拌入木屑或棉籽皮料內(nèi)，制成菌塊,、培養(yǎng)其形成子實(shí)體,。還可用于制原種、栽培種,。 培養(yǎng)液體菌種,，可將培養(yǎng)液裝入三角瓶中，約占空瓶的五分之一重量,。用搖瓶機(jī)（也稱搖床）來(lái)培養(yǎng),。搖瓶機(jī)有旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式兩種，一般多用往復(fù)式,。液體培養(yǎng)基可用馬鈴薯汁（加糖）,，麥芽汁配制，也可用玉米粉,、豆餅粉,、糖、無(wú)機(jī)鹽等配制,?？梢曰旌吓囵B(yǎng)基，因適用于多種食用菌和藥用菌的培養(yǎng),，均有好效果,。組分：豆餅 粉2％， 玉米粉1％,， 葡萄糖3％,，酵母粉0.5％，磷酸二氫鉀0.1％,，碳酸鈣 0.2％,， pH自然， 12℃滅菌半小時(shí),。然后接種培養(yǎng),。 如果生產(chǎn)量較大，在三角瓶的基礎(chǔ)上,，再逐級(jí)擴(kuò)大種子缸,，發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層通氣發(fā)酵，產(chǎn)生大量菌種,。但由于生產(chǎn)中要求設(shè)備繁多,，技術(shù)性強(qiáng)，我們還應(yīng)創(chuàng)造條件,；實(shí)現(xiàn)食用菌栽培的現(xiàn)代化,。
（四）菌種質(zhì)量的鑒定 菌種質(zhì)量鑒定較為適合的方法是，做出菇試驗(yàn)。但是時(shí)間比較長(zhǎng),。在購(gòu)置菌種時(shí),，或在菌種生產(chǎn)中，如何能知菌絲生長(zhǎng)情況,，快速判斷菌種質(zhì)量,？我們介紹幾種方法： 1.肉眼觀察：優(yōu)良菌種菌絲濃白，絨狀,，粗壯密集,，生長(zhǎng)整齊，速度快,，香味濃厚,。 2.優(yōu)良菌種標(biāo)準(zhǔn)可歸納為："純、香,、正,、壯、潤(rùn)"五個(gè)字,。檢查時(shí),，打開(kāi)瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體,，觀察色澤，聞其氣味,，手捏料塊檢查其含水量,，看是否符合上述要求標(biāo)準(zhǔn)。 3. 顯微鏡檢查：挑取少量菌絲,，置顯微鏡上觀察其形態(tài),，菌絲分枝，分隔情況,，鎖狀聯(lián)合,，細(xì)胞膜的厚薄。 培養(yǎng)觀察：從菌種瓶中挑取小塊菌絲體,，接種斜面試管培養(yǎng)基上,，置23℃～25℃恒溫中培養(yǎng)，經(jīng)五周后檢查菌種生活力,。如果菌絲生長(zhǎng)快,，旺盛純一，健壯濃 厚,，長(zhǎng)且整齊,，則表示菌種的生活力強(qiáng)。 4.分塊法：在桌上放一張白紙，把菌齡相同的菌種從瓶?jī)?nèi)取出一大塊,，用手分成2塊,，再把2塊分成4塊，4塊 分成8塊,，依次進(jìn)行,。優(yōu)良菌種整塊多，碎渣少,。劣次菌整塊少,，碎渣多。 5.液體菌種鑒別：當(dāng)三角瓶或發(fā)酵缸培養(yǎng)3-7天后,，如液面出現(xiàn)氣泡,，產(chǎn)生"油皮"、混濁等現(xiàn)象,，說(shuō)明菌種本 身帶有雜菌,。如菌塊上浮，或遲遲長(zhǎng)出很薄的菌絲層,，則說(shuō)明菌種生活力弱,。白塊四周的菌絲生長(zhǎng)快、濃白,、棉絮狀,，表明菌種生命力強(qiáng)。
（五）菌種生產(chǎn)過(guò)程中的雜茵防治 在 生產(chǎn)菌種時(shí),，要時(shí)刻注意雜菌污染,，以防為主，一旦發(fā)生,，*很不容易,。所以整個(gè)制種過(guò)程都必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行。接種箱及所有分離,、接種的用具,、器皿，都 要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒滅菌,。工作人員的雙手要用消毒劑清洗,，并穿戴消過(guò)毒的工作服、帽和口罩,，動(dòng)作要敏捷,、準(zhǔn)確，盡量不要講話走動(dòng),，以防空氣中的雜菌感染,。 分離母種時(shí),，選擇出菇早、生活力強(qiáng),，潮菇是關(guān)鍵,，因它生活力強(qiáng)，接種后迅速占領(lǐng)陣地,，無(wú)雜菌侵入的機(jī)會(huì),。 被污染的菌種，原因是多方面的,，一般是滅菌不*所致,，或因接種時(shí)無(wú)菌操作不嚴(yán)、瓶蓋不合適造成的,。所以滅菌一定要*,，建議在接種萌將培養(yǎng)基置25℃左右恒溫箱中做效果檢查，經(jīng)2天不長(zhǎng)雜菌,，說(shuō)明*,，可以使用，接種過(guò)程中一定要嚴(yán)格無(wú)菌操作,。 污染雜菌另一個(gè)原因可能是分離母種時(shí)感染雜菌,，因種菇表面帶菌，消毒不*,，通過(guò)組織塊將雜菌帶入培養(yǎng)基,。 總之，污染機(jī)會(huì)很多,，要注意環(huán)境消毒,，按無(wú)菌操作規(guī)程*滅菌，層層把關(guān),，環(huán)環(huán)抓緊，嚴(yán)加注意,；提離菌種質(zhì)量,。
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