輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，NADP+和NADPH 含量測(cè)定可以計(jì)算 NADP（NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān),。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,，而且在 PPP 途徑,、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用,。

測(cè)定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+和NADPH。NADPH 通過(guò)PMS 的遞氫作用,，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚,，570nm 下檢測(cè)吸光值，從而測(cè)定NADPH 含量,。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH,，從而檢測(cè)NADP+含量。

組成：

試劑二：粉劑×1 支,，-20 ℃保存,，用時(shí)加入 3ml 蒸餾水，混勻,；溶解后 4 ℃保存一周,；試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存,，用時(shí)加入 3ml 蒸餾水,，混勻；溶解后 4℃保存一周,；試劑四：粉劑×1 支,，4 ℃保存，用時(shí)加入 3ml 蒸餾水,，混勻,；溶解后 4℃保存一周；

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、96 孔板、研缽,、冰和蒸餾水,。

NADP+和 NADPH 的提取：

1,、 血清（漿）中 NADP⁺和NADPH 的提取

NADP⁺的提取：按照血清（漿）體積（ml）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿）,，加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

NADPH 的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿）,，加入 1ml 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

2,、組織中NADP⁺和NADPH 的提取：

NADP⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加

入 1ml 酸性提取液）,，冰浴研磨,，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后,，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液,，加入 500μl 堿性提取液使之中和,，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

NADPH 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，

加入 1ml 堿性提取液）,，冰浴研磨,，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

3,、 細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP⁺和NADPH 的提取：

NADP⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清,，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：酸性提取液體

積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 酸性提取液）,，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W,，超聲 3s,，間隔 10s，重復(fù) 30 次）,，95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后,，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和,，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

NADPH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清,，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：堿性提取液體

積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 堿性提取液）,，超聲波破碎（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）,，95℃水浴 5min（蓋緊,，以防止水分散失）,；冰浴中冷卻后,，10000g 4 ℃離心 10min,；取 500μl 上清液,，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻,，10000g 4 ℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 570nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、加樣表(在 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置 5min 后,，20000g,，25℃離心 5min,，棄上清，沉淀中加入：

混勻,，取 200μl 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中,，570nm 下讀取對(duì)照吸光值 A1 和測(cè)定管吸光值

A2，計(jì)算△A=A2-A1,。

注意事項(xiàng)

1,、如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一,、二,、三和四按比例配成混合液。

2,、對(duì)照管和測(cè)定管的測(cè)定步驟的區(qū)別：對(duì)照管加完試劑一,、二、三,、四和五后必須馬上加試劑六,；測(cè)定管加完試劑一、二,、三,、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六,。

3、反應(yīng)過(guò)程中注意避光,。

4,、若NADP+測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 測(cè)定中△A（A2-A1）≤0.0259,，說(shuō)明樣本中輔酶含量較低,，已低于檢測(cè)限，可做如下調(diào)整：（1）將測(cè)定管避光靜置時(shí)間 20min 延長(zhǎng)到 60min,；（2）在提取階段增加取樣量,，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5,、由于每一個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管,，本試劑盒 100 管保證測(cè) 48 個(gè)NADP⁺或NADPH.

NADP+和 NADPH 含量的計(jì)算：

（一）NADP⁺含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.0985x + 0.0144，R² = 0.9998,；其中y 為△A,，x 為NADP⁺濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NADP⁺含量計(jì)算

NADP⁺含量(nmol/ml）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）

2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP⁺含量計(jì)算 (1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

NADP⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）

（二）NADPH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.6198x + 0.0259，R² = 0.9977,；其中y 為△A,，x 為NADPH 濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NADPH 含量計(jì)算

NADPH 含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）

2,、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞中NADPH 含量計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02ml,；V2：加入提取液體積,，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml,； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml,； W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn),。

注意：*低檢測(cè)限為 0.01nmol/ml 或 0.01nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot