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在生命活動的代謝過程中不斷產(chǎn)生各種自由基,，其中羥自由基(?OH)是體內(nèi)的活性氧，可介導(dǎo)許多生理變化,，

羥自由基作用于體內(nèi)蛋白質(zhì),、核酸、脂類等生物分子,，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損,，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂引起疾病，

如引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),，并損傷膜結(jié)構(gòu)和功能,。羥自由基清除能力是樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，

在抗氧化類保健品和藥品研究中得到廣泛應(yīng)用,。

羥自由基清除率檢測試劑盒(Fenton比色法)又稱羥自由基清除能力檢測試劑盒或羥自由基檢測試劑盒,，其檢測原理是

H2O2/Fe2+ 通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，并將Fe2+氧化為Fe3+,，導(dǎo)致紅色的鄰二氮菲-Fe2+氧化為無色的鄰二氮菲-Fe3+

,，使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失，可通過酶標(biāo)儀測定530~540nm處吸光度的變化,，據(jù)此可計(jì)算出羥自由基的

含量變化,，即可計(jì)算出樣品的羥自由基清除率或清除能力，主要用于植物組織,、血清,、血漿等樣本。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,，

不適用于臨床診斷或其他用途,。

操作步驟(僅供參考)：

自備材料：

1、蒸餾水

2,、電子天平,、研缽或勻漿器、離心管或試管

3,、低溫離心機(jī),、恒溫箱或水浴鍋,、酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板

操作步驟(僅供參考)：

1,、準(zhǔn)備樣品∶

①植物樣品︰取1g植物組織或水果中層果肉,，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿,，4℃ 10000r/min

離心15~20min,，留取上清液，-20℃凍存,，用于苯丙氨解氨酶的檢測,。

②血漿、血清和尿液樣品︰血漿,、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定,，-20℃凍存，用于苯丙解氨的檢測,。

③細(xì)胞或組織樣品∶取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液,，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，4℃ 10000r/min離心15~20min,，取上清液,，

-20℃凍存，用于苯丙酸解氨酶的檢測,。④高活性樣品︰如果樣品中含有較高活性的苯丙解氨酶,，可以使用蒸餾水或PAL

Lysis Buffer稀釋進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、PAL加樣∶

取96孔板,，按照下表設(shè)置對照孔,、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入,，并

注意避免產(chǎn)生氣泡,。如果樣品中的PAL活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定,，樣品的檢測最好能設(shè)置2平行孔,，

求平均值。

加入物（μl）對照孔測定孔

蒸餾水150100

待測樣本5050

PAL Assay Buffer-50

3,、PAL檢測︰

以對照孔為對照(調(diào)零),，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為   A測定0);40℃準(zhǔn)確孵育1h，立即加入10μl PAL終止

液終止反應(yīng)(備選方案),，以對照孔為對照調(diào)零,，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為A測定1)。

注意︰加入PAL終止液終止反應(yīng)為非必須步驟,，可37℃準(zhǔn)確孵育1h后直接以對照孔為對照調(diào)零,，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定

孔的吸光度,。

注意事項(xiàng)∶

1、待測樣品中不能含有酶抑制劑,，同時(shí)需避免反復(fù)凍融,。

2、獲得上清液為PAL酶液,，應(yīng)盡快檢測,，亦可-20°℃保存。

3,、如果沒有可測定紫外區(qū)的酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板，也可以使用紫外分光光度計(jì)和石英比色皿,，但應(yīng)注意比色杯的最小檢測體積,。

4、每次檢測指標(biāo)不宜過多,，否則操作時(shí)間不一,，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。5,、為了您的安全和健康,，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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