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硝酸還原酶(Nitrate reductase,，NR)是一種氧化還原酶，可分為參與硝酸鹽同化的同化型還原酶和催化以硝酸鹽為活體氧化的

最終電子受休的硝酸鹽呼吸異化型(呼吸型)還原酶,。硝酸還原酶是植物氮素代謝中氮素同化的關(guān)鍵酶,，該酶與作物吸收利用氮肥

有關(guān)，對(duì)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量有影響,，因此可以把硝酸還原酶的活力當(dāng)作營養(yǎng)診斷,、農(nóng)田施肥或作物育種的生理生化指標(biāo)。

硝酸還原酶(NR)測定方法可分為活體法和離體法,，活體法步驟簡,，適合快速,、多組測定；離體法比較復(fù)雜,，但重復(fù)性好,。

硝酸還原酶(NR)檢測試劑盒檢測原理是硝酸還原酶催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，其反應(yīng)如下：

NO3-+NADH+H+→NO2-+NAD++H2O,，產(chǎn)生的亞硝酸鹽與磺胺及萘胺在酸性條件下定量生成穩(wěn)定的紅色偶氮化合物,，

于酶標(biāo)儀520nm處檢測吸光度,，由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示硝酸還原酶的活性,，一般以單位μg/(goh)表示，

主要用于檢測植物樣本,、血清等中硝酸還原酶活性,，尤其適用于離體植物組織硝酸還原酶的活力。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,，

不適用于臨床診斷或其他用途,。

操作步驟(僅供參考)：

自備材料：

1、蒸餾水

2,、電子天平,、研缽或勻漿器、離心管或試管

3,、低溫離心機(jī),、恒溫箱或水浴鍋、酶標(biāo)儀,、酶標(biāo)板

操作步驟(僅供參考)：

1,、準(zhǔn)備樣品∶

①植物樣品︰取1g植物組織或水果中層果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer,，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿,，4℃ 10000r/min

離心15~20min，留取上清液,，-20℃凍存,，用于苯丙氨解氨酶的檢測。

②血漿,、血清和尿液樣品︰血漿,、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定，-20℃凍存,，用于苯丙解氨的檢測,。

③細(xì)胞或組織樣品∶取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿,，4℃ 10000r/min離心15~20min,，取上清液,，

-20℃凍存，用于苯丙酸解氨酶的檢測,。④高活性樣品︰如果樣品中含有較高活性的苯丙解氨酶,，可以使用蒸餾水或PAL

Lysis Buffer稀釋進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、PAL加樣∶

取96孔板,，按照下表設(shè)置對(duì)照孔,、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入,，并

注意避免產(chǎn)生氣泡,。如果樣品中的PAL活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定,，樣品的檢測最好能設(shè)置2平行孔,，

求平均值。

加入物（μl）對(duì)照孔測定孔

蒸餾水150100

待測樣本5050

PAL Assay Buffer-50

3,、PAL檢測︰

以對(duì)照孔為對(duì)照(調(diào)零),，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為   A測定0);40℃準(zhǔn)確孵育1h，立即加入10μl PAL終止

液終止反應(yīng)(備選方案),，以對(duì)照孔為對(duì)照調(diào)零,，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為A測定1)。

注意︰加入PAL終止液終止反應(yīng)為非必須步驟,，可37℃準(zhǔn)確孵育1h后直接以對(duì)照孔為對(duì)照調(diào)零,，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定

孔的吸光度。

注意事項(xiàng)∶

1,、待測樣品中不能含有酶抑制劑,，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2,、獲得上清液為PAL酶液,，應(yīng)盡快檢測，亦可-20°℃保存,。

3,、如果沒有可測定紫外區(qū)的酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板，也可以使用紫外分光光度計(jì)和石英比色皿,，但應(yīng)注意比色杯的最小檢測體積,。

4、每次檢測指標(biāo)不宜過多,，否則操作時(shí)間不一,，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。5,、為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

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