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細(xì)胞名稱：LLCLL/2小鼠肺癌細(xì)胞ATCC

細(xì)胞代次：P4

細(xì)胞規(guī)格：T25瓶（包郵）/2冷凍管（需加干冰運(yùn)輸費(fèi)）

細(xì)胞凍存：無血清凍存液

細(xì)胞傳代：第一次建議1:2

細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法,。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶，消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,，將細(xì)胞瓶放入37℃,、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,，前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好,。（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時(shí)要將蓋子擰松,，傳代后建議一瓶用原瓶的培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的培養(yǎng)基,，以便進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)）

培養(yǎng)步驟

細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時(shí),，將瓶裝的培養(yǎng)液收集至離心管中，留5ml培養(yǎng)基,，放入37℃,、5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),，傳代具體步驟如下細(xì)胞傳代：

A1、對(duì)于懸浮細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞,，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液,，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻,，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式,，棄半數(shù)培養(yǎng)基后,，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中,。

A2,、懸浮細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，將T25 培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中1000rpm

離心5min,；

2、棄上清,，沉淀細(xì)胞加入1ml/支的雅吉生物無血清凍存液（C7001）,，混勻后加入凍存管中。（如：凍一支,，加入 1ml 無血清凍存液即可）

3,、將凍存細(xì)胞直接放入－80℃冰箱即可；如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,，需在-80℃冰箱存

放 24 小時(shí)以上,。

B1、對(duì)于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考如下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2. 添加0.25%消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上培養(yǎng)基終止消化,。

3.輕輕吹打細(xì)胞,，使之脫落后吸出，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基重懸,。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25瓶）,，補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃,、5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

B2、貼壁細(xì)胞凍存：

1,、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),，棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2,、添加0.25%消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心 5min,；

3,、 棄上清，沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號(hào)：C7001）,，混勻后加入凍存管中,。

細(xì)胞復(fù)蘇：

1、從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,，快速將其置入 37℃水浴中解凍,， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；

2,、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min,；

3,、棄上清，沉淀用5ml培養(yǎng)基重懸,，接種至T25培養(yǎng)瓶,，放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4,、第二天,，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞比較特殊,，如貼壁不牢,，在運(yùn)輸過程中發(fā)生容易細(xì)胞脫落，這是正?，F(xiàn)象,。請(qǐng)將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5min,，收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對(duì)比培養(yǎng)）,，沉淀加入消化液1-2ml，輕輕吹打,，重懸,，消化1-2分鐘后，加5ml培養(yǎng)基終止反應(yīng),。再離心,，棄上清,，加1-2ml培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25）,，補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,，最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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