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pcr實驗原理：

    qPCR基于傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，通過逐漸擴增目標(biāo)DNA或cDNA的數(shù)量使其可檢測,。與傳統(tǒng)PCR不同的是,，qPCR在擴增過程中同時進行熒光信號的實時監(jiān)測。

    qPCR的原理基于熒光探針（例如TaqMan探針或SYBR Green I染料）,。這些探針通過與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合,，在PCR過程中釋放熒光信號。

    SYBR Green I：該染料能與DNA雙鏈結(jié)合,，當(dāng)PCR擴增產(chǎn)生新的雙鏈DNA時,，SYBR Green I與其結(jié)合并發(fā)出熒光信號。

    TaqMan探針：該探針由引物和熒光探針組成,，熒光探針含有一個熒光染料和一個熒光猝滅劑。在PCR擴增過程中,，熒光探針通過引物特異性結(jié)合到目標(biāo)序列上,，并且Taqpolymerase酵素的核酸酶活性會切除掉熒光探針上的猝滅劑，導(dǎo)致熒光染料釋放出信號,。

PCR擴增中避免非特異性產(chǎn)物的綜合策略

一,、優(yōu)化引物設(shè)計

提高引物特異性

確保引物與目標(biāo)序列高度匹配，避開非目標(biāo)區(qū)域的相似序列（如通過BLAST比對驗證）,；

引物長度控制在18-24 bp,，GC含量40–60%，避免引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),。

減少引物濃度

過高引物濃度易引發(fā)非特異性結(jié)合或引物二聚體,，建議調(diào)整至0.1–0.5 μM。

二,、調(diào)控PCR反應(yīng)條件

調(diào)整退火溫度

適當(dāng)提高退火溫度?（接近引物Tm值±2℃）,，增強引物與模板結(jié)合的嚴(yán)謹(jǐn)性，減少非特異性結(jié)合,。

優(yōu)化Mg2?濃度

Mg2?濃度過高（＞2.5 mM）會降低反應(yīng)特異性,，需通過梯度實驗確定最佳濃度（通常1.5–2.5 mM）。

縮短延伸時間與循環(huán)次數(shù)?

延伸時間按產(chǎn)物長度設(shè)定（1 kb/min）,，避免過度延伸導(dǎo)致副產(chǎn)物積累,；

減少循環(huán)次數(shù)（通常25–35次），防止非特異性產(chǎn)物指數(shù)級擴增,。

使用熱啟動Taq酶

熱啟動聚合酶在低溫下無活性,，可抑制早期非特異性擴增。

三,、防污染操作

分區(qū)操作?

實驗區(qū)域分為樣本處理區(qū),、試劑配制區(qū)及擴增區(qū),，避免氣溶膠污染。

使用UNG酶

添加尿嘧啶糖基化酶（UNG）降解含dU的污染產(chǎn)物,，抑制殘留DNA擴增,。

設(shè)置陰性對照

加入無模板對照（NTC）以監(jiān)測試劑或環(huán)境污染物。

四,、模板與試劑優(yōu)化

純化模板DNA

模板降解或雜質(zhì)（如多糖,、蛋白）可能引發(fā)非特異性擴增，需通過電泳或純化試劑盒驗證完整性,。

調(diào)整模板用量

過高模板量會增加非特異性結(jié)合的幾率,，建議按實驗體系推薦量添加（通常1–100 ng）。

五,、其他輔助策略

使用降落PCR（Touchdown PCR）

初始退火溫度高于Tm值并逐漸降低,，優(yōu)先擴增高特異性產(chǎn)物45。

添加增強劑?

DMSO（5–10%）,、甜菜堿（1–1.5 M）等可減少模板二級結(jié)構(gòu)干擾,，提升特異性。

巢式PCR

分兩輪擴增,，使用外側(cè)和內(nèi)側(cè)兩對引物,，降低背景干擾