實時熒光探針PCR技術(shù),，又稱為qPCR，是一種結(jié)合了PCR擴增和熒光檢測的分子生物學技術(shù),。它能夠在PCR反應進行的同時，實時監(jiān)測特定DNA序列的擴增情況,。該技術(shù)主要依賴于熒光標記的探針,，這些探針能夠特異性地結(jié)合到目標DNA序列上。
在PCR循環(huán)中,，隨著目標DNA的指數(shù)級擴增,，熒光信號也相應增強。熒光信號的強度與擴增產(chǎn)物的量成正比,，因此可以通過熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR反應的進程,。實時熒光探針PCR技術(shù)通常使用兩種類型的熒光探針：TaqMan探針和SYBR Green。
SYBR Green是一種DNA染料,，它能夠非特異性地結(jié)合到雙鏈DNA上,，具有使用簡便,，價格便宜等優(yōu)點而被廣泛使用。但其最大的缺點是缺乏特異性,，即染料可以與任何dsDNA結(jié)合,。因此，qPCR反應中有非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)會增加熒光值,，影響定量結(jié)果的準確性,，而TaqMan探針法的出現(xiàn)很好地解決了染料法非特異性的問題，這也讓TaqMan探針法在檢測領(lǐng)域大放異彩,！接下來,，就讓我們了解一下TaqMan探針法qPCR在支原體檢測方面的應用。
TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,，它含有一個熒光報告基團和一個淬滅基團,。當探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收,。在PCR擴增過程中,，TaqMan探針與目標DNA序列結(jié)合，Taq DNA聚合酶的5'到3'外切酶活性會切割探針,，導致報告基團和淬滅基團分離,，從而發(fā)出熒光信號。切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,，因此,，通過檢測PCR反應體系中的熒光強度可以達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。
檢測機制與定量分析?
根據(jù)檢測方式不同,，PCR試劑盒分為?常規(guī)PCR?和?實時熒光定量PCR?兩類：
常規(guī)PCR檢測
擴增后通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物大小,，定性判斷目標片段是否存在。
實時熒光定量PCR（qPCR）
熒光標記?：加入熒光探針（如TaqMan探針）或DNA結(jié)合染料（如SYBR Green）,；
信號監(jiān)測?：每輪擴增后實時檢測熒光強度,，通過?t值（熒光達到閾值所需循環(huán)數(shù)）定量起始模板量；
標準曲線法?：利用已知濃度的標準品建立Ct值與模板濃度的線性關(guān)系,，計算樣品濃度
探針法qPCR在支原體檢測中的應用
引物設計
針對支原體16S rRNA序列,，下載后進行序列比對，篩選支原體特異性的區(qū)段,，尋找兩端特異中間保守的區(qū)段,，設計引物。一般選擇多對正反向引物,，和多條相對應的探針引物,。
內(nèi)參設計
同時為了保證實驗的有效性和穩(wěn)定性，往往還會設計一對內(nèi)參引物和內(nèi)參熒光探針,，用于監(jiān)控每次反應過程的穩(wěn)定性,。
反應模板
檢測時需取培養(yǎng)至少2~3天的細胞培養(yǎng)物,，進行核酸提取后，作為模板進行qPCR反應,。
目前市場上優(yōu)秀的qPCR支原體檢測試劑盒可檢測支原體種類可達到39~180種以上,，檢測靈敏度可達到10cfu/mL。
1高特異性：TaqMan探針通過與目標DNA序列特異性結(jié)合,，確保了檢測的高特異性,。
2高靈敏度：該方法可以檢測極低濃度的核酸模板，靈敏度高,。
3實時監(jiān)測：在PCR反應過程中實時監(jiān)測熒光信號,，可以準確地定量分析。
4減少污染風險：由于不需要后續(xù)處理,，減少了PCR產(chǎn)物污染的風險,。
多重檢測能力：可以同時使用不同顏色的熒光標記，進行多重檢測,。
5簡化操作：制作成預混液后,，大大簡化操作步驟，易于標準化和自動化,。TaqMan探針法qPCR應用于支原體檢測的優(yōu)點
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