熒光檢測 PCR 定量檢測,，即實時熒光定量 PCR（qPCR），其原理是在普通 PCR 的基礎(chǔ)上,，加入熒光基團,，通過對 PCR 過程中熒光信號的實時監(jiān)測,，實現(xiàn)對核酸模板的定量分析，具體如下：
熒光信號產(chǎn)生機制
熒光染料法：常用的熒光染料如 SYBR Green I,，它可以特異性地結(jié)合到雙鏈 DNA 的小溝部位,。在 PCR 反應(yīng)體系中，當 DNA 進行復(fù)制形成雙鏈時,，SYBR Green I 就會結(jié)合到雙鏈 DNA 上,，從而被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號。而且熒光信號的強度與雙鏈 DNA 的含量成正比關(guān)系,。
探針法：使用的是 TaqMan 探針等,。TaqMan 探針是一段與目標 DNA 序列特異性互補的寡核苷酸，其 5' 端標記有熒光報告基團（如 FAM）,，3' 端標記有熒光淬滅基團（如 TAMRA）,。在 PCR 反應(yīng)過程中，當引物延伸到探針結(jié)合部位時,，Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性會將探針降解,，使得熒光報告基團與淬滅基團分離，從而產(chǎn)生熒光信號,。每擴增一條 DNA 鏈,，就會有一個探針被切斷，釋放出一個熒光信號,。
定量原理
標準曲線法：通過一系列已知濃度的標準品模板進行 PCR 擴增,，得到不同濃度標準品對應(yīng)的熒光信號值，以標準品的起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標,，以對應(yīng)的熒光閾值循環(huán)數(shù)（Ct 值）為縱坐標,，繪制出標準曲線。在相同條件下對未知樣品進行 PCR 擴增,，根據(jù)其得到的 Ct 值,，從標準曲線上就可以計算出未知樣品的起始拷貝數(shù)。
Ct 值的定義與應(yīng)用：Ct 值是指在 PCR 擴增過程中,，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù),。研究表明，在 PCR 反應(yīng)的指數(shù)增長期,，Ct 值與起始模板量的對數(shù)呈線性關(guān)系,，即起始模板量越多，Ct 值越??；反之，起始模板量越少,，Ct 值越大,。因此,，可以利用 Ct 值來對模板進行定量分析。
熒光檢測 PCR 定量,，即實時熒光定量 PCR（qPCR）,，具有以下優(yōu)點：
靈敏度高：能夠檢測到極低拷貝數(shù)的核酸模板，可對痕量核酸進行定量分析,，比如在病毒感染早期,，血液中病毒核酸含量極低時，也能準確檢測出病毒的存在并進行定量,，有助于疾病的早期診斷,。
特異性強：無論是使用熒光染料法還是探針法，都具有很高的特異性,。探針法中,，TaqMan 探針與目標 DNA 序列特異性互補結(jié)合，只有當引物和探針都與目標序列準確結(jié)合時才能產(chǎn)生熒光信號,，極大地提高了檢測的特異性,；熒光染料法中，SYBR Green I 只結(jié)合雙鏈 DNA,，且在 PCR 引物設(shè)計時會確保其與目標序列特異性結(jié)合，從而保證了檢測的特異性,。
精確性好：通過對熒光信號的實時監(jiān)測和對 Ct 值的精確測定,，以及標準曲線的建立，能夠?qū)崿F(xiàn)對核酸模板的準確定量,。實驗結(jié)果的重復(fù)性好,，變異系數(shù)通常較低，在科研和臨床診斷等領(lǐng)域能夠提供可靠的數(shù)據(jù),。
快速高效：整個 PCR 過程在封閉的反應(yīng)體系中進行,，無需像傳統(tǒng) PCR 那樣在反應(yīng)結(jié)束后進行開蓋檢測，減少了操作步驟和時間,，同時也降低了污染的風險,。一般在 1 - 2 小時內(nèi)就能完成檢測，能夠快速得到檢測結(jié)果,，適用于緊急情況和大規(guī)模樣本的檢測,。
高通量：可以同時對多個樣本進行檢測，配合自動化的儀器設(shè)備,，能夠?qū)崿F(xiàn)一次運行檢測幾十甚至上百個樣本,，大大提高了檢測效率，適用于大規(guī)模的疾病篩查,、基因表達分析等研究和應(yīng)用,。
實時監(jiān)測：在 PCR 擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化,，能夠直接觀察到核酸擴增的動態(tài)過程，了解反應(yīng)的進程和效率,，及時發(fā)現(xiàn)異常情況,，如引物二聚體的形成、非特異性擴增等,，有助于對實驗結(jié)果進行準確的分析和判斷,。
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