實驗?zāi)康摹?/span>
1.掌握用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法。
2.學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的篩選方法,。
【實驗原理】
質(zhì)粒在不同的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移是微生物世界中一種普遍的現(xiàn)象,，一個細(xì)菌品系通過吸收另一個細(xì)菌品系的質(zhì)粒DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現(xiàn)象叫做轉(zhuǎn)化,，獲得了外源DNA的細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子,。
在基因克隆技術(shù)中，所謂轉(zhuǎn)化是指質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒被導(dǎo)入受體細(xì)胞,，表達相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下,，在選擇性培養(yǎng)基上長出轉(zhuǎn)化子的過程,。
質(zhì)粒必須通過轉(zhuǎn)化進入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，才能進行擴增和表達,，從而獲得大量的克隆基因,使我們能夠進行進一步的DNA操作,，如亞克隆等；或者獲得其表達產(chǎn)物,。轉(zhuǎn)化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關(guān),。細(xì)菌吸收外源DNA的能力最高時的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）。
有些種類的細(xì)菌在其生長的任一階段都處于感受態(tài),，而另一些細(xì)菌只有處于某個生長時期時（一般為對數(shù)生長早,、中期），才會處于感受態(tài),如本實驗所用的大腸桿菌,。用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長早中期的細(xì)菌可以大大提高細(xì)菌吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的能力,。
對這種現(xiàn)象的一種解釋是CaCl2能使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增強，從而提高轉(zhuǎn)化率,。這種轉(zhuǎn)化方法稱為“化學(xué)法",。目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流,，在細(xì)胞上形成孔洞,，使外源DNA進入胞內(nèi),，從而實現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
電激轉(zhuǎn)化的效率往往比化學(xué)法高出1到2個數(shù)量級,，達到1X108轉(zhuǎn)化子/μgDNA,，甚至1X109轉(zhuǎn)化子/μgDNA，所以常用于文庫構(gòu)建時的轉(zhuǎn)化或遺傳篩選,。
微生物轉(zhuǎn)化是基因工程的常用技術(shù),，大腸桿菌是基因工程中常用的受體菌，本實驗即是用前面實驗獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞,。
【試劑與器材】
<一>試劑
1．LB液體培養(yǎng)基:參見附錄
每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中,，另各取3mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中,，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘,。
2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:
配1LLB液體培養(yǎng)基，加入20g瓊脂粉和1支攪拌棒,，同上高壓滅菌,，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55℃左右,加氨芐青霉素(Ampicillin)至終濃度100μg/ml(Amp儲存液一般為100mg/mL),倒平板,，每皿倒約15mL,，室溫放置過夜至冷凝水揮發(fā)干凈。使用前半小時在培養(yǎng)基表面加20μL50mg/mLX-gal和100μL0.1mol/LIPTG,，涂勻,，待這兩種化合物滲入瓊脂后，即可用于轉(zhuǎn)化菌的涂布,。
每組制備LB平板2個，LB/Amp平板5個,，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個,。
3．IPTG儲存液(0.1mol/L)：1.2gIPTG加水至50ml，過濾除菌,，4℃儲存,。
4．X-gal儲存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中，過濾除菌,，4℃儲存,。
5．1mol/LCaCl2儲存液，使用濃度為0.1mol/L,，CaCl2應(yīng)使用分析純,，配100mL，高壓滅菌,，全班用,。
6．甘油(滅菌)，全班50mL，同上高壓滅菌,。
7．酸洗無菌玻璃珠,，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝,，同上高壓滅菌,，烘干備用。
<二>器材
1.37℃溫箱,、水浴鍋,、恒溫振蕩器等
2.高速冷凍離心機
3.微量移液器等
<三>菌株
大腸桿菌DH5α
【操作方法】
1、感受態(tài)細(xì)胞的制備（無菌操作）
1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個DH5α大菌落接種到3mLLB培養(yǎng)液中（2）,，37℃劇烈振蕩（210-240r/min）培養(yǎng)過夜（3）,。
2）取1mL過夜培養(yǎng)物,接種到含100mLLB培養(yǎng)液的500mL錐瓶中，37℃劇烈振蕩,，直至培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度達到OD600為0.375-0.4（4）
3）培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入2只50mL離心管中,，冰上放置10分鐘，4,000r/min,4℃離心15分鐘，棄上清（5）。
4）將菌體懸浮于10～20mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液中,冰上放置20分鐘(6),。
5）4,000rpm,4℃,離心10分鐘,，棄上清，然后將細(xì)菌輕輕懸浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）,。若不立即進行轉(zhuǎn)化實驗，則進行第6步操作，反之,，則進入轉(zhuǎn)化操作。
6）緩慢滴入甘油(滅菌)至終濃度為15％,輕柔混勻,，將細(xì)菌分裝成0.5ml/每管,，立即液氮冷凍，轉(zhuǎn)入-70℃冰箱儲存,，可在2個月內(nèi)使用（8）,。
2、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
1）設(shè)計好實驗項目,，如正,、負(fù)對照（參考如下表格，按表格內(nèi)容操作）,；
2）從-80℃冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態(tài)細(xì)胞,置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10）,，立即分裝到預(yù)冷的1.5mL離心管中，每管體積參見上表,，插入冰上待用,；
3）對轉(zhuǎn)化管,，加入連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕混勻,；為保險起見,，也可先加入一半的連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕混勻,，剩下的一半置-20℃冰箱保存,；
4）冰上放置30分鐘（11）；
5）放入42℃水浴中,，熱激40秒（12）,；
6）迅速插入冰上，放置5分鐘,；
7）對第1,、2項，加入500μLLB培養(yǎng)基,，其余加入250μLLB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)1小時（13）,；
8）對第1項，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2個LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上,；對第2項,，分別取3、30和100μL細(xì)菌培養(yǎng)液,，各加無菌水至150μL（不超過200μL）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的是計算轉(zhuǎn)化率）,；對其余各項，分別各取一半涂布于LB/Amp平板上,，余下的轉(zhuǎn)化液置4℃冰箱保存（14）,。倒置平板，37℃培養(yǎng)12-14小時,。一般來說,，含有活性半乳糖苷酶的細(xì)菌比無活性酶的細(xì)菌生長慢，故過夜培養(yǎng)后可見到毫米大小的陽性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大?。?5）。
9）挑取白色菌落進行鑒定（見下一個實驗）,。
【注意事項與提示】
（1）倒平板時應(yīng)避免培養(yǎng)基溫度過高,，若溫度過高，則加入的氨芐青霉素會失效,，且培養(yǎng)基凝固后表面及皿蓋會形成大量冷凝水,，易于造成污染及影響單菌落的形成。若用手掌感受培養(yǎng)基覺得很燙但尚可忍受時,，培養(yǎng)基溫度即為55℃左右,。制備好的LB/Amp平板可于4℃冰箱儲存2個月,，時間過長氨芐青霉素將會失效。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好現(xiàn)用,。
（2）DH5α在平板上過夜生長后,，可置冰箱中保存一個月左右；接種新鮮的菌落或菌液有利于細(xì)菌細(xì)胞的同步快速生長,，從而使細(xì)菌群體在達到一定的OD值后（0.375）大部分細(xì)胞都處于感受態(tài),。
（3）DH5α的生長需要氧氣，劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細(xì)菌的生長
（4）達到細(xì)菌對數(shù)生長早,、中期,，需時約2.0~2.5小時，此步驟至為關(guān)鍵,，若超過此階段,，則轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
（5）低溫操作的目的是使細(xì)胞不再生長,，保持其感受態(tài),。
（6）此步驟的目的是洗滌細(xì)胞。
（7）此時細(xì)胞較脆,，懸浮時動作要輕,，可用移液槍輕輕吸打。
（8）-70℃冰箱儲存的感受態(tài)細(xì)胞在6-8周后,，轉(zhuǎn)化率很快降低,。可用一已知標(biāo)準(zhǔn)及濃度的閉環(huán)質(zhì)粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力,。
（9）實驗中一定要設(shè)計正負(fù)對照,，如用無DNA轉(zhuǎn)化物的感受態(tài)細(xì)菌鋪板，若有菌落生長,，說明其中抗生素濃度不夠或感受態(tài)細(xì)胞已被污染,。加樣時速度要快，但要有條不紊,，切勿加錯,！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項中所加連接產(chǎn)物的量可根據(jù)連接反應(yīng)的終體積而定,，一般加一半或2/3,，其余置－20℃保存。
（10）從-80℃冰箱中取出冷凍的指管后,，也可用雙手搓指管,，利用掌心的溫度解凍。解凍時間勿過長,。
（11）至少30min,，可延長至1h左右,。
（12）掌握時間，過長會致死細(xì)胞,。在許多實驗方案中,，熱激時間設(shè)為90至120秒，目前已有實驗證明如此長的熱激時間是沒有必要的,，且會引起轉(zhuǎn)化效率的下降,。熱激前加入相當(dāng)于轉(zhuǎn)化液體積1/10的DMSO可提高轉(zhuǎn)化效率10倍左右，加入DMSO后請勿再劇烈振蕩,。
（13）此步驟使得細(xì)菌恢復(fù)正常并讓β-內(nèi)酰氨酶基因表達,。
（14）此步驟可在實驗出現(xiàn)錯誤后進行補救。
（15）培養(yǎng)時間勿過長,，以免衛(wèi)星菌落的出現(xiàn),。很多因素都可以影響轉(zhuǎn)化的效率，特別需要注意的有兩點,，一是制備感受態(tài)細(xì)胞時的OD值,，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如MiliQ）配制,。
【實驗安排】
實驗前兩天挑E.coli菌種在LB平板上劃線,，37℃培養(yǎng)過夜。實驗前一天各組要將試劑準(zhǔn)備好,，包括培養(yǎng)基的消毒滅菌,。下午臨下課時從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)化完畢,，次日一早觀察記錄結(jié)果,，并清理余下的菌種試劑等。
【實驗報告要求與思考題】
1．制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化時,，應(yīng)特別注意哪些環(huán)節(jié),。
2．轉(zhuǎn)化效率的計算：轉(zhuǎn)化效率是指每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)目，請列表表示你的轉(zhuǎn)化結(jié)果并算出轉(zhuǎn)化率（列出計算公式）,。你所做實驗的轉(zhuǎn)化效率（正對照）是多少,？如果過低（如低于104cfu/μgDNA），請分析可能的原因,。需要注意的是,，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率是非常低的，為什么,？
3．若實驗出現(xiàn)不正常的結(jié)果，請分析原因,。
附錄：大腸桿菌的高效轉(zhuǎn)化方法
一,、試劑
TB溶液：1.512gPIPES,，1.1025gCaCl2，9.31875gKCl,，溶于水,，以5NKOH調(diào)pH6.7，再加入5.44225gMnCl2,，定容至500ml,，0.22?m濾膜過濾滅菌，4℃保存,。
SOB培養(yǎng)基：Tryptone20g(OXOID公司),；Yeastextract5g(OXOID公司)；NaCl0.5g,，加800ml雙蒸水,，加入250mmol/LKCl溶液10ml，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.0,，定容至1,000ml,，高壓滅菌，4℃保存,；使用前加入5ml經(jīng)高壓滅菌的2mol/LMgCl2溶液,。
SOC培養(yǎng)基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后,，降溫至60℃或以下時,，加入20ml經(jīng)過濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4℃保存,。
DMSO
二,、方法
（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備
1.將E.coliDH5α，涂布于LB(A-)培養(yǎng)基上,，37℃過夜,。
2.挑取2-3個直徑2-3mm的大菌落，接種到50mlSOB培養(yǎng)基中,。在250ml三角瓶中18℃,，200-250rpm振蕩培養(yǎng)，直到OD=0.6,，約需要36-48hr,。
3.將三角瓶冰浴10分鐘。
4.轉(zhuǎn)移菌液到50ml離心管,。2,500g,，10min，4℃,。
5.菌體用16ml冰預(yù)冷的TB溶液懸浮,，冰浴10min,。
6.2,500g，10min,，4℃,。
7.菌體用4ml冰預(yù)冷的TB溶液懸浮，加入280ulDMSO,。
8.菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管,。每管200ul。液氮冷卻,，保存于液氮中,。大月0分鐘后，轉(zhuǎn)移到-40℃冰箱保存,。
（二）轉(zhuǎn)化
1.將LB抗性平板,，SOC培養(yǎng)基，于37℃預(yù)熱,。
2.室溫溶解感受態(tài)細(xì)胞,。
3.取200uL菌液加入1.5mL離心管中，放于冰中,。
4.加入1-5uL質(zhì)粒溶液,，用槍頭混勻，冰浴30min,。
5.42℃熱激30秒,，冰浴。
6.加入800uLSOC培養(yǎng)基,，37℃,，250r/min，1hr,。
7.涂布LB抗性平板,，37℃過夜。
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