實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
1.掌握用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞的原理和方法。
2.學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的篩選方法,。
【實(shí)驗(yàn)原理】
質(zhì)粒在不同的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移是微生物世界中一種普遍的現(xiàn)象,，一個(gè)細(xì)菌品系通過(guò)吸收另一個(gè)細(xì)菌品系的質(zhì)粒DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現(xiàn)象叫做轉(zhuǎn)化,，獲得了外源DNA的細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子,。
在基因克隆技術(shù)中,，所謂轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒或重組質(zhì)粒被導(dǎo)入受體細(xì)胞,，表達(dá)相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因,，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子的過(guò)程,。
質(zhì)粒必須通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),，才能進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量的克隆基因,使我們能夠進(jìn)行進(jìn)一步的DNA操作,，如亞克隆等,；或者獲得其表達(dá)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關(guān),。細(xì)菌吸收外源DNA的能力最高時(shí)的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）,。
有些種類的細(xì)菌在其生長(zhǎng)的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細(xì)菌只有處于某個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)（一般為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早,、中期）,，才會(huì)處于感受態(tài),如本實(shí)驗(yàn)所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早中期的細(xì)菌可以大大提高細(xì)菌吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的能力,。
對(duì)這種現(xiàn)象的一種解釋是CaCl2能使細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增強(qiáng),，從而提高轉(zhuǎn)化率。這種轉(zhuǎn)化方法稱為“化學(xué)法",。目前還可以使用電激的方法,，通過(guò)瞬間的高壓電流，在細(xì)胞上形成孔洞,，使外源DNA進(jìn)入胞內(nèi),，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
電激轉(zhuǎn)化的效率往往比化學(xué)法高出1到2個(gè)數(shù)量級(jí),，達(dá)到1X108轉(zhuǎn)化子/μgDNA,，甚至1X109轉(zhuǎn)化子/μgDNA，所以常用于文庫(kù)構(gòu)建時(shí)的轉(zhuǎn)化或遺傳篩選,。
微生物轉(zhuǎn)化是基因工程的常用技術(shù),，大腸桿菌是基因工程中常用的受體菌，本實(shí)驗(yàn)即是用前面實(shí)驗(yàn)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞,。
【試劑與器材】
<一>試劑
1．LB液體培養(yǎng)基:參見附錄
每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中,，另各取3mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中,，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘,。
2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:
配1LLB液體培養(yǎng)基，加入20g瓊脂粉和1支攪拌棒,，同上高壓滅菌,，趁熱取出置攪拌器上冷卻,，待冷至55℃左右,加氨芐青霉素(Ampicillin)至終濃度100μg/ml(Amp儲(chǔ)存液一般為100mg/mL),倒平板，每皿倒約15mL,，室溫放置過(guò)夜至冷凝水揮發(fā)干凈,。使用前半小時(shí)在培養(yǎng)基表面加20μL50mg/mLX-gal和100μL0.1mol/LIPTG，涂勻,，待這兩種化合物滲入瓊脂后,，即可用于轉(zhuǎn)化菌的涂布。
每組制備LB平板2個(gè),，LB/Amp平板5個(gè),，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個(gè)。
3．IPTG儲(chǔ)存液(0.1mol/L)：1.2gIPTG加水至50ml,，過(guò)濾除菌,，4℃儲(chǔ)存。
4．X-gal儲(chǔ)存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中,，過(guò)濾除菌,，4℃儲(chǔ)存。
5．1mol/LCaCl2儲(chǔ)存液,，使用濃度為0.1mol/L,，CaCl2應(yīng)使用分析純,，配100mL,，高壓滅菌，全班用,。
6．甘油(滅菌),，全班50mL，同上高壓滅菌,。
7．酸洗無(wú)菌玻璃珠,，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝,，同上高壓滅菌,，烘干備用。
<二>器材
1.37℃溫箱,、水浴鍋,、恒溫振蕩器等
2.高速冷凍離心機(jī)
3.微量移液器等
<三>菌株
大腸桿菌DH5α
【操作方法】
1、感受態(tài)細(xì)胞的制備（無(wú)菌操作）
1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個(gè)DH5α大菌落接種到3mLLB培養(yǎng)液中（2）,，37℃劇烈振蕩（210-240r/min）培養(yǎng)過(guò)夜（3）,。
2）取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物,接種到含100mLLB培養(yǎng)液的500mL錐瓶中，37℃劇烈振蕩,，直至培養(yǎng)液中細(xì)菌濃度達(dá)到OD600為0.375-0.4（4）
3）培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入2只50mL離心管中,，冰上放置10分鐘,，4,000r/min,4℃離心15分鐘，棄上清（5）,。
4）將菌體懸浮于10～20mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液中,冰上放置20分鐘(6),。
5）4,000rpm,4℃,離心10分鐘，棄上清,，然后將細(xì)菌輕輕懸浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）,。若不立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，則進(jìn)行第6步操作,，反之,，則進(jìn)入轉(zhuǎn)化操作。
6）緩慢滴入甘油(滅菌)至終濃度為15％,輕柔混勻,，將細(xì)菌分裝成0.5ml/每管,，立即液氮冷凍，轉(zhuǎn)入-70℃冰箱儲(chǔ)存,，可在2個(gè)月內(nèi)使用（8）,。
2、感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
1）設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,，如正,、負(fù)對(duì)照（參考如下表格，按表格內(nèi)容操作）,；
2）從-80℃冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態(tài)細(xì)胞,置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10）,，立即分裝到預(yù)冷的1.5mL離心管中，每管體積參見上表,，插入冰上待用,；
3）對(duì)轉(zhuǎn)化管，加入連接產(chǎn)物DNA溶液,，輕輕混勻,；為保險(xiǎn)起見，也可先加入一半的連接產(chǎn)物DNA溶液,，輕輕混勻,，剩下的一半置-20℃冰箱保存；
4）冰上放置30分鐘（11）,；
5）放入42℃水浴中,，熱激40秒（12）；
6）迅速插入冰上,，放置5分鐘,；
7）對(duì)第1、2項(xiàng)，加入500μLLB培養(yǎng)基,，其余加入250μLLB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)1小時(shí)（13）,；
8）對(duì)第1項(xiàng)，各取200μL直接用玻璃珠涂布于2個(gè)LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上,；對(duì)第2項(xiàng),，分別取3、30和100μL細(xì)菌培養(yǎng)液,，各加無(wú)菌水至150μL（不超過(guò)200μL）涂LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（此步驟的目的是計(jì)算轉(zhuǎn)化率）,；對(duì)其余各項(xiàng)，分別各取一半涂布于LB/Amp平板上,，余下的轉(zhuǎn)化液置4℃冰箱保存（14）,。倒置平板，37℃培養(yǎng)12-14小時(shí),。一般來(lái)說(shuō),，含有活性半乳糖苷酶的細(xì)菌比無(wú)活性酶的細(xì)菌生長(zhǎng)慢，故過(guò)夜培養(yǎng)后可見到毫米大小的陽(yáng)性白色菌落而陰性的蘭色菌落只有針尖大?。?5）,。
9）挑取白色菌落進(jìn)行鑒定（見下一個(gè)實(shí)驗(yàn)）。
【注意事項(xiàng)與提示】
（1）倒平板時(shí)應(yīng)避免培養(yǎng)基溫度過(guò)高,，若溫度過(guò)高,，則加入的氨芐青霉素會(huì)失效，且培養(yǎng)基凝固后表面及皿蓋會(huì)形成大量冷凝水,，易于造成污染及影響單菌落的形成,。若用手掌感受培養(yǎng)基覺得很燙但尚可忍受時(shí)，培養(yǎng)基溫度即為55℃左右,。制備好的LB/Amp平板可于4℃冰箱儲(chǔ)存2個(gè)月,，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)氨芐青霉素將會(huì)失效,。加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好現(xiàn)用,。
（2）DH5α在平板上過(guò)夜生長(zhǎng)后，可置冰箱中保存一個(gè)月左右,；接種新鮮的菌落或菌液有利于細(xì)菌細(xì)胞的同步快速生長(zhǎng),，從而使細(xì)菌群體在達(dá)到一定的OD值后（0.375）大部分細(xì)胞都處于感受態(tài)。
（3）DH5α的生長(zhǎng)需要氧氣,，劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細(xì)菌的生長(zhǎng)
（4）達(dá)到細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早,、中期，需時(shí)約2.0~2.5小時(shí),，此步驟至為關(guān)鍵,，若超過(guò)此階段，則轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
（5）低溫操作的目的是使細(xì)胞不再生長(zhǎng),，保持其感受態(tài),。
（6）此步驟的目的是洗滌細(xì)胞。
（7）此時(shí)細(xì)胞較脆,，懸浮時(shí)動(dòng)作要輕,，可用移液槍輕輕吸打。
（8）-70℃冰箱儲(chǔ)存的感受態(tài)細(xì)胞在6-8周后,，轉(zhuǎn)化率很快降低,。可用一已知標(biāo)準(zhǔn)及濃度的閉環(huán)質(zhì)粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力,。
（9）實(shí)驗(yàn)中一定要設(shè)計(jì)正負(fù)對(duì)照,，如用無(wú)DNA轉(zhuǎn)化物的感受態(tài)細(xì)菌鋪板，若有菌落生長(zhǎng),，說(shuō)明其中抗生素濃度不夠或感受態(tài)細(xì)胞已被污染,。加樣時(shí)速度要快，但要有條不紊,，切勿加錯(cuò),！加完樣用槍尖稍攪勻。第1項(xiàng)中所加連接產(chǎn)物的量可根據(jù)連接反應(yīng)的終體積而定,，一般加一半或2/3,，其余置－20℃保存。
（10）從-80℃冰箱中取出冷凍的指管后,，也可用雙手搓指管,，利用掌心的溫度解凍。解凍時(shí)間勿過(guò)長(zhǎng),。
（11）至少30min,，可延長(zhǎng)至1h左右。
（12）掌握時(shí)間,，過(guò)長(zhǎng)會(huì)致死細(xì)胞,。在許多實(shí)驗(yàn)方案中，熱激時(shí)間設(shè)為90至120秒,，目前已有實(shí)驗(yàn)證明如此長(zhǎng)的熱激時(shí)間是沒有必要的,，且會(huì)引起轉(zhuǎn)化效率的下降。熱激前加入相當(dāng)于轉(zhuǎn)化液體積1/10的DMSO可提高轉(zhuǎn)化效率10倍左右,，加入DMSO后請(qǐng)勿再劇烈振蕩,。
（13）此步驟使得細(xì)菌恢復(fù)正常并讓?duì)?內(nèi)酰氨酶基因表達(dá)。
（14）此步驟可在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)錯(cuò)誤后進(jìn)行補(bǔ)救,。
（15）培養(yǎng)時(shí)間勿過(guò)長(zhǎng),，以免衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。很多因素都可以影響轉(zhuǎn)化的效率，特別需要注意的有兩點(diǎn),，一是制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)的OD值,，二是所用試劑要分析純以上，并用雙蒸水或超純水（如MiliQ）配制,。
【實(shí)驗(yàn)安排】
實(shí)驗(yàn)前兩天挑E.coli菌種在LB平板上劃線,，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)前一天各組要將試劑準(zhǔn)備好,，包括培養(yǎng)基的消毒滅菌,。下午臨下課時(shí)從平板上挑新鮮的單菌落接種到3mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化完畢,，次日一早觀察記錄結(jié)果,，并清理余下的菌種試劑等。
【實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求與思考題】
1．制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化時(shí),，應(yīng)特別注意哪些環(huán)節(jié),。
2．轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化效率是指每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)目，請(qǐng)列表表示你的轉(zhuǎn)化結(jié)果并算出轉(zhuǎn)化率（列出計(jì)算公式）,。你所做實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率（正對(duì)照）是多少,？如果過(guò)低（如低于104cfu/μgDNA），請(qǐng)分析可能的原因,。需要注意的是,，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率是非常低的，為什么,？
3．若實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)不正常的結(jié)果,，請(qǐng)分析原因。
附錄：大腸桿菌的高效轉(zhuǎn)化方法
一,、試劑
TB溶液：1.512gPIPES,，1.1025gCaCl2，9.31875gKCl,，溶于水,，以5NKOH調(diào)pH6.7，再加入5.44225gMnCl2,，定容至500ml,，0.22?m濾膜過(guò)濾滅菌，4℃保存,。
SOB培養(yǎng)基：Tryptone20g(OXOID公司)；Yeastextract5g(OXOID公司),；NaCl0.5g,，加800ml雙蒸水，加入250mmol/LKCl溶液10ml，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.0,，定容至1,000ml,，高壓滅菌，4℃保存,；使用前加入5ml經(jīng)高壓滅菌的2mol/LMgCl2溶液,。
SOC培養(yǎng)基：含20mmol/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后,，降溫至60℃或以下時(shí),，加入20ml經(jīng)過(guò)濾除菌的1mmol/L葡萄糖溶液，4℃保存,。
DMSO
二,、方法
（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備
1.將E.coliDH5α，涂布于LB(A-)培養(yǎng)基上,，37℃過(guò)夜,。
2.挑取2-3個(gè)直徑2-3mm的大菌落，接種到50mlSOB培養(yǎng)基中,。在250ml三角瓶中18℃,，200-250rpm振蕩培養(yǎng)，直到OD=0.6,，約需要36-48hr,。
3.將三角瓶冰浴10分鐘。
4.轉(zhuǎn)移菌液到50ml離心管,。2,500g,，10min，4℃,。
5.菌體用16ml冰預(yù)冷的TB溶液懸浮,，冰浴10min。
6.2,500g,，10min,，4℃。
7.菌體用4ml冰預(yù)冷的TB溶液懸浮,，加入280ulDMSO,。
8.菌液于冰浴10分鐘后分裝到凍存管。每管200ul,。液氮冷卻,，保存于液氮中。大月0分鐘后,，轉(zhuǎn)移到-40℃冰箱保存,。
（二）轉(zhuǎn)化
1.將LB抗性平板,，SOC培養(yǎng)基，于37℃預(yù)熱,。
2.室溫溶解感受態(tài)細(xì)胞,。
3.取200uL菌液加入1.5mL離心管中，放于冰中,。
4.加入1-5uL質(zhì)粒溶液,，用槍頭混勻，冰浴30min,。
5.42℃熱激30秒,，冰浴。
6.加入800uLSOC培養(yǎng)基,，37℃,，250r/min，1hr,。
7.涂布LB抗性平板,，37℃過(guò)夜。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
2
立即詢價(jià)
您提交后，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)