養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴們都知道，細(xì)胞一定要傳代,，因為細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷的繁殖,，數(shù)量也隨之增加，然而培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶的空間有限,，增殖受到抑制,，所以必須將一部分細(xì)胞移至別的培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞有足夠生長空間,。
細(xì)胞傳代也不僅僅是為細(xì)胞安一個更大的“家",，更重要的，是使細(xì)胞系或細(xì)胞株進(jìn)一步增殖,，這樣,，我們才能有足夠的細(xì)胞做各種各樣的實驗。
但是,，對于傳代的時間,，很多小伙伴都掌握不好，因為對于不同的細(xì)胞來說,，判斷能否開始傳代的標(biāo)準(zhǔn)略有不同,，今天，我們就主要來聊一下,，細(xì)胞傳代的時間問題,。
什么時候進(jìn)行細(xì)胞傳代?
對于貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)而言，判斷是否需要傳代主要看以下2個方面：
• 細(xì)胞密度：
貼壁培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,、未達(dá)到匯合狀態(tài)時即應(yīng)進(jìn)行傳代,，正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時會停止生長 (接觸抑制)，重新接種后需要較長時間才能恢復(fù),，轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖,，但是在經(jīng)過大約兩個倍增時間后通常會變質(zhì)。類似地,，
懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期,、未達(dá)到匯合狀態(tài)時也應(yīng)進(jìn)行傳代,。達(dá)到匯合狀態(tài)時，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會聚集成團(tuán)塊,，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時培養(yǎng)基會變得渾濁,。
• 培養(yǎng)基耗竭：
生長培養(yǎng)基 pH 值降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物,。乳酸有細(xì)胞毒性,，而且 pH 值降低也是細(xì)胞生長的不利因素。pH 值改變的速度通常取決于培養(yǎng)體系中的細(xì)胞濃度,，細(xì)胞濃度越高,，培養(yǎng)基耗竭的速度越快。
如果發(fā)現(xiàn) pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 單位),，同時細(xì)胞濃度增大,，則應(yīng)對細(xì)胞進(jìn)行傳代。
細(xì)胞傳代時間安排
注意,，一定要嚴(yán)格按照預(yù)定時間進(jìn)行細(xì)胞傳代,，這樣才能確保細(xì)胞的生物學(xué)行為穩(wěn)定，便于監(jiān)測其健康狀態(tài),。
要從某一接種密度開始逐漸調(diào)整細(xì)胞接種密度,，直到達(dá)到適合該細(xì)胞的穩(wěn)定生長速度和產(chǎn)量,，細(xì)胞偏離如此確定的生長模式通常表示細(xì)胞健康狀況不佳 (例如：變質(zhì),、污染) 或者培養(yǎng)體系的某一組分功能異常 (例如：未達(dá)到最佳溫度，培養(yǎng)基過于陳舊),。
強(qiáng)烈建議大家保留詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)記錄,，記錄加料和傳代時間、所用培養(yǎng)基種類,、解離方法,、分種率、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,、接種濃度,、產(chǎn)量和抗生素用法。
最好按照傳代時間安排開展實驗和其他非常規(guī)操作 (如更換培養(yǎng)基種類),，如果您的實驗安排與常規(guī)傳代時間安排不吻合,，則應(yīng)確保當(dāng)細(xì)胞仍處于延滯期或者已經(jīng)達(dá)到匯合狀態(tài)、停止生長時,，不進(jìn)行傳代,。
貼壁細(xì)胞傳代流程:
以下實驗方案介紹了貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代的一般流程,為自己所用的細(xì)胞系傳代時，建議您嚴(yán)格遵守實驗中所有產(chǎn)品附帶的操作說明,偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致細(xì)胞表型異常,，甚至培養(yǎng)失敗,。
(1)傳代前準(zhǔn)備
用具紫外照射消毒(30min)：無菌培養(yǎng)瓶,，15ml離心管，移液管,，移液槍,，槍頭。
倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù),。
(2)胰蛋白酶/EDTA消化
從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞(將蓋子擰緊)，75%酒精進(jìn)行瓶口消毒,，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基,，PBS緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，按25m2/ml消化液比例加入消化液,，消化液中EDTA濃度視不同細(xì)胞而定,。放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi),，加入6ml細(xì)胞培養(yǎng)基中止消化,，消化時間為1-5min，具體以細(xì)胞而議,，采用無菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面,，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打,，后上下吹打的方式,，取所有的細(xì)胞懸液放入干凈的15ml離心管內(nèi)，每分鐘1000rpm,，RT5min,。
(3)制備細(xì)胞懸液及培養(yǎng)
吸取上清液丟棄，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀,，向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入適量培養(yǎng)基,，吹打混勻，吹打過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡,，以1:2的比例進(jìn)行分瓶,。
(4)結(jié)果觀察
第二天觀察細(xì)胞情況，細(xì)胞培養(yǎng)換液時間一般2-3天,。
(5)注意事項
1 嚴(yán)格無菌
2 適度消化：把握好消化液的最佳濃度
3 吹打細(xì)胞動作要輕柔
懸浮細(xì)胞傳代流程
懸浮細(xì)胞傳代就比較容易了,，可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量,，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可,。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時,，可以將懸液移到離心管內(nèi),，1000-1500rpm離心3min,，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液,，吹打至均勻,，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
看了以上的內(nèi)容,，你學(xué)會了嗎？細(xì)胞傳代是一個需要不斷積累經(jīng)驗的技術(shù)活兒,，除了對時間的把握之外,，還有很多方面需要注意。那么,，如果你實在傳代不好,，導(dǎo)致珍貴的細(xì)胞污染或者死亡了怎么辦呢？也別著急,，來找客服,！
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