目錄:上海博盛龍生物科技有限公司>>實驗試劑>>核酸/蛋白電泳與分析試劑>> Ni層析介質(NTA) Ni NTA Beads
| 供貨周期 | 一周 | 規(guī)格 | 5ml |
|---|---|---|---|
| 貨號 | BDTL0011-5 |
純化流程
1 Buffer的準備
Ni層析介質(NTA) Ni NTA Beads可使用下列推薦Buffer,，也可根據(jù)自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系,，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫,，或者高pH上樣,，低pH洗脫,。Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm濾膜過濾除菌。因為Ni層析介質（NTA）可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化,，兩種方法所需Buffer不同,，具體配置方法見表3，表4和表5,。
表3. 可溶性組氨的酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方
名稱 體積 配方
Lysis Buffer
1L 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
10 mM imidazole （0.68 g imidazole）
使用NaOH溶液調節(jié)pH至8.0,，
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
Wash Buffer
1L 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
20 mM imidazole（1.36 g imidazole）
使用NaOH溶液調節(jié)pH至8.0,，
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌,。
Elution Buffer 1L 50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
250 mM imidazole （17.0 g imidazole）
使用NaOH溶液調節(jié)pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌,。
表4. 包涵體組氨的酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方,，pH洗脫方式
名稱 體積 配方
Lysis Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）
100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）
100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）
使用鹽酸溶液調節(jié)pH至8.0
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
Wash Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea ）
100 mM NaH2PO4 （15.60 g NaH2PO4·2H2O）
100 mM Tris·HCl （15.76 g Tris·HCl）
使用鹽酸溶液調節(jié)pH至6.3
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌,。
Elution Buffer 1L 8 M Urea（480.50 g urea）
100 mM NaH2PO4（15.60 g NaH2PO4·2H2O）
100 mM Tris·HCl（15.76 g Tris·HCl）
使用鹽酸溶液調節(jié)pH至4.5
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌,。
表5. 包涵體組氨的酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方，咪唑洗脫方式
名稱 體積 配方
Lysis Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
10 mM imidazole （0.68 g imidazole）
使用NaOH溶液調節(jié)pH至8.0,，
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌,。
Wash Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
20 mM imidazole （1.36 g imidazole）
使用NaOH溶液調節(jié)pH至8.0，
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌,。
Elution Buffer 1L 8 M Urea （480.50 g urea）
50 mM NaH2PO4 （7.80 g NaH2PO4·2H2O）
300 mM NaCl （17.54 g NaCl）
250 mM imidazole （17.0 g imidazole）
使用NaOH溶液調節(jié)pH至8.0,，
使用0.22 或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
2 樣品準備
2.1 細菌或酵母表達可溶性蛋白
1.挑取單菌落到培養(yǎng)基中,，根據(jù)載體使用說明,，加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。
2.表達結束后,，將培養(yǎng)液轉移到離心杯中,，7,000rpm(7500 ×g)離心15min收集菌體，然后按照菌體：Lysis Buffer=1：10（W/V）加入Lysis Buffer,，加入最終濃度為1mM的PMSF,。加入溶菌的酶（工作濃度為0.2-0.4mg/ml，如果表達的宿主細胞內(nèi)含pLysS 或pLysE,，可以不加溶菌的酶）,，同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與層析介質的結合,。
3.將菌體沉淀懸浮起來,，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10μg/ml RNaseA和5μg/ml DNase I），混勻,，放置于冰上,，然后冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清,。
4.將澄清的破碎液轉移至離心管中,，10,000rpm(15000 ×g) 4℃離心20-30分鐘。取上清,，置于冰上備用或-20℃保存,。
2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白
1.將細胞培養(yǎng)液轉移至離心杯,，5,000rpm(3800 ×g)離心10min，收集菌體得上清,，如上清中不含EDTA,、組氨的酸和還原劑等物質，即可直接加入柱子使用,；如含有EDTA,、組氨的酸和還原劑等物質，蛋白還需用Lysis Buffer 下透析才能加入柱子,。
2.對于大體積上清,，需加硫酸銨沉淀濃縮，蛋白還需用Lysis Buffer 透析后才能加入柱子,。
2.3包涵體蛋白純化（變性條件）
1.將培養(yǎng)液轉移到離心杯中,，7,000rpm(7500 ×g)，離心15min收集菌體棄掉上清,。
2.按照菌體：Lysis buffer（不含8M尿素）=1:10（W/V）將菌體懸浮起來,，混勻，冰浴超聲波破碎,。
3.將破碎液轉移至離心管中,，10,000rpm(15000 ×g)下4℃離心20-30min，去掉上清,步驟2和3可以重復一次,。
4.按照菌體：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10（W/V）將包涵體懸浮起來,。
5.變性條件下進行His標簽抗體純化，具體緩沖液配方見表4,，表5,。
3Ni NTA Beads 重力柱的裝填
1.取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片,，加入適量純水潤洗柱管和墊片,，關閉下出口。
2.將Ni NTA Beads混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質實際體積占懸液的一半）,，打開下出口流干保護液,。
3.加入適量純水沖洗介質，待柱管中液體重力流干后,，關閉下出口,。
4.裝入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙,，且保持水平,。
5.裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液,，4-30℃保存,。
4樣品純化
4.1 孵育法純化
1.根據(jù)純化的樣品量，取適量層析介質加入離心管中,，1000 rpm離心1 min,，吸棄上清；也可加入重力柱中,，流干保護液,。
2.向離心管中加入5倍介質體積的Lysis buffer清洗介質，1000 rpm離心1 min,，吸棄上清,；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗,，直接重力流干Lysis buffer,；重復兩次以上。
3.加入樣品,，封閉離心管或重力柱管,，4 ℃振蕩孵育2-4 h或者37 ℃孵育30 min-2 h。
4.孵育結束后,，1000 rpm離心1 min,吸棄上清,，或過濾收集介質，上清保留作為流穿,，用于電泳鑒定,。
5.用5倍介質體積的Wash Buffer清洗介質，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾,，去除上清（注意不要吸到介質）,，重復3-5次，中間建議更換新離心管,。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜,。
6.加入3-5倍柱體積的Elution Buffer進行洗脫，室溫孵育10-15min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復2-3次,。
4.2 重力柱法純化
1.將裝填好的層析介質重力柱,，用5倍柱體積的Lysis buffer進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,，重復2-3次,。
2.將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min,保證樣品和介質充分接觸,，收集流出液,，可以反復上樣增加結合效率。
3.用10-15倍柱體積的Wash Buffer進行洗雜,，去除非特異性吸附的雜蛋白,，收集洗雜液。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜,。
4.使用5-10倍柱體積的Elution Buffer洗脫,，分段收集，每一個柱體積收集一管,，分別檢測，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫,，又可以得到高純度和高濃度的蛋白,。
注：上述步驟介質洗脫結束后，先用Lysis buffer沖洗3倍柱體積,，然后用純水沖洗5倍柱體積,，再用20%的乙醇沖洗2個柱體積，然后將介質置于4度保存,。
2.4 SDS-PAGE檢測
將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分,、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。
3. 在位清洗
當層析介質使用過程中反壓過高或層析介質上面出現(xiàn)明顯的污染時,，需要進行在位清洗（Cleaning-in-Place, CIP）,。
建議按照下面操作去除層析介質上殘留的污染物，如沉淀蛋白,、疏水蛋白和脂蛋白等,。
去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類
通過使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積,，接觸時間為15-20分鐘可以去除此類污染物,。然后，再使用10倍柱體積的去離子水清洗,。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液,，清洗層析介質2倍柱體積。例如，含有0.1–0.5% 非離子去污劑的0.1 M 醋酸溶液,，接觸時間為1–2小時,。去污劑處理后，需要使用70%的乙醇清洗5個柱體積,，以去除去污劑,。最后使用10倍柱體積的去離子水清洗。
去除離子作用結合的蛋白
使用1.5M NaCl溶液接觸時間為10-15分鐘清洗,。然后,，再使用去離子水清洗10個柱體積。
4. 層析介質再生
組氨的酸標簽蛋白親和純化層析介質所帶的鎳離子不需要經(jīng)常螯合去除和重新掛鎳離子,。當層析介質使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺,，或者層析介質載量明顯變低時，需要進行對層析介質進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子,，也就是層析介質再生,。將層析介質裝填在合適的層析柱內(nèi)，按照下面操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子,。
1.使用去離子水清洗5倍柱體積,；
2.使用5倍柱體積100 mM EDTA (pH 8.0)剝離鎳離子；
3.使用10倍柱體積去離子水清洗填料,；
4.使用0.5M NaOH清洗5倍柱體積,停留10-15min,；
5.使用去離子水清洗填料，直至pH中性,；
6.使用3-5倍柱體積100 mM NiSO4再生掛鎳,；
7.使用10倍柱體積去離子水清洗；
再生的層析介質,，可以立即使用,，如不立即使用，需將層析介質懸浮于等體積的20%的乙醇中,，置于4-30°C保存,。
5. 問題及解決方案
Ni層析介質(NTA) Ni NTA Beads 問題 原因分析 推薦解決方案
柱子反壓過高 層析介質被堵塞 按照3.對層析介質的在位清洗。
裂解液中含有微小的固體顆粒,，建議上柱前使用濾膜（0.2 or 0.45 μm）過濾,，或者離心去除。
樣品太粘稠 樣品中含有高濃度的核酸,，加長破碎時間直至粘度降低,，或者添加DNase I （終濃度5 μg/ml），Mg2+ （終濃度 1 mM）,，冰上孵育10-15分鐘,。
緩沖液太粘稠 有機溶劑或者蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會引起反壓增高,，降低操作流速。
洗脫組分中沒有目的蛋白 蛋白可能是包涵體,，沒有在上清中 可以通過電泳檢測裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,，包涵體蛋白需要按照包涵體蛋白的純化方式。
表達量太低 優(yōu)化表達條件,。
目的蛋白結合比較弱,，在洗雜步驟被洗下來了 提高wash Buffer的pH，或者降低咪唑濃度,。
目的蛋白結合過強,，不容易洗脫下來 降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑濃度,。
使用10-100mM EDTA溶液剝離鎳離子,，同時得到目的蛋白。
蛋白降解 在4°C下進行純化操作,。
菌體破碎時添加一些蛋白酶抑制劑,。
洗脫組分不純（含有多種蛋白） 洗雜不增加Wash Buffer體積。
樣品中含有其他的組氨的酸標簽蛋白 通過調節(jié)pH值,，或者咪唑濃度來優(yōu)化洗雜條件,。再使用其他的純化手段（如離子交換，疏水等）進一步純化洗脫組分,。
層析介質顏色變淺或變成白色 鎳離子脫落或被剝離 按照4.層析介質再生中的建議重新掛鎳離子
層析介質呈現(xiàn)褐色 緩沖液中含有DTT等還原劑 適當降低還原劑DTT的濃度至2mM以下,，或者改用巰基乙醇。
上樣過程中蛋白發(fā)生沉淀 操作溫度太高 4℃下進行上樣,。
蛋白發(fā)生聚集 在樣品和所有的緩沖液中添加穩(wěn)定劑,，如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20,。
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