Co-IP（免疫共沉淀,，co-inmunoprecipitation）是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復(fù)合體的一項技術(shù)，能夠特異性富集所研究的目的蛋白,。
免疫共沉淀Co-IP實驗步驟
細(xì)胞轉(zhuǎn)染
1.鋪細(xì)胞,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。本次轉(zhuǎn)染的兩個蛋白分別帶有FLAG和HA標(biāo)簽,。
裂解細(xì)胞
2.去除培養(yǎng)基,，PBS吹下細(xì)胞，離心去上清,。將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中,，PBS洗，離心去上清,，加1ml裂解液,。
3.冰上孵育40min，每10min震蕩一次,。
4.超聲破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)和打斷染色質(zhì),。冰上操作。
這個功率和時間要你自己摸索,，不同細(xì)胞不同機(jī)器都會有差別,，一般的國產(chǎn)機(jī)器對10^7細(xì)胞用20%功率超聲4分鐘左右即可比較充分（超聲2秒，停2秒）,。直到溶液相對比較清澈,，沒有絲狀DNA。
5. 4度,，12000 rpm/min離心10mins,。
6.轉(zhuǎn)移上清(上清體積會有所增加，可能是因為細(xì)胞溶解了)到新的預(yù)冷的試管中,。取50ul上清作為input,。
7.將剩余樣品分為兩份,其中一份加入FLAG(MOUSE)抗體1uL（轉(zhuǎn)染的蛋白帶有FLAG標(biāo)簽），一份加入相應(yīng)宿主的普通IgG(mouse),4℃輕搖過夜,，使抗體和目標(biāo)蛋白充分結(jié)合,。
抗體與beads的結(jié)合
8.將beads吸出至新管（每個107樣品準(zhǔn)備40ul beads懸液，約含20ul Protein A/G beads,，細(xì)胞較少時可適當(dāng)減少,，最少10ul懸液否則后續(xù)操作會很困難）用2倍體積(PBS+0.1%triton-100)洗滌3次，去上清,。3000rpm離心1min基本可以充分沉淀,，轉(zhuǎn)速時間可調(diào)。
9.用等體積的buffer重懸beads,。
10.在每個樣品中加入20ul beads懸液,，4℃輕搖2小時,，使抗體和beads充分結(jié)合。
樣品的收集和洗滌
11.將IP過后的樣品離心 3000rpm 1min,。
12.將上清轉(zhuǎn)移至新管 標(biāo)記為Flow through,。
13.加入500ul (PBS+0.1%triton-100)洗滌beads 4℃輕搖5min 3000rpm 1min 棄上清。
14.洗滌三次,，最后一次盡量去除上清,。
樣品的洗脫
15.用30-100ul裂解液重懸beads，具體體積根據(jù)SDS-PAGE需求自定,。
16.將樣品和input中加入合適體積的loading buffer混勻,，必要時可以將Flow through進(jìn)行制樣檢測。
17.95℃-100℃熱變性10-15min,，冷卻后凍存?zhèn)溆谩?/span>
18.SDS-PAGE和WB檢測,。IP用的是FLAG抗體，檢測HA,。
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