在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation),，有人稱之為孵育,，在ELISA試劑盒中似不恰當(dāng)。

  抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會,，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。

      這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。

      溫育常采用的溫度有43 ℃,、37 ℃、室溫和4 ℃（冰箱溫度）等,。37 ℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時,，實驗表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37 ℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)ding峰,。

       為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43 ℃進(jìn)行,，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4 ℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜,，以形成最多的沉淀,。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中一般不予采用,。

      保溫的方式除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA試劑盒板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上,。

      若用保溫箱,，ELISA試劑盒板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,，在盒底墊濕的紗布,，最后將ELISA試劑盒板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此,。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。

      室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25 ℃,，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點,，一個人操作時,，一次不宜多于兩塊板同時測定。