以下是2023.11.18新版:ELISA實(shí)驗(yàn)的原理總結(jié)：

ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附測定,，是一類常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,，然后利用酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的抗體或抗原與之孵育,，加入顯色劑顯色，通過酶標(biāo)儀測定待測物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異,，繪制出酶活曲線得出待測物濃度,。

一、四種常見ELISA方法:

1.直接ELISA

將抗原固定于ELISA板上,，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原,。相較于其它類型的ELISA實(shí)驗(yàn)，直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,，檢測速度快,，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng),，測定結(jié)果不容易出錯(cuò),。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與ELISA板結(jié)合,，實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高,。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)不太靈活,。另外由于沒有使用二抗,，信號(hào)沒有被放大，降低了測定的靈敏度,。

2.間接ELISA

先將抗原結(jié)合到ELISA板上,，隨后分兩步進(jìn)行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色,。與直接ELISA相比,，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗,，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體,，更經(jīng)濟(jì),。間接ELISA還提供了更大的靈活性，因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用,。間接ELISA實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合）,，可能會(huì)增加背景，同時(shí)與直接ELISA相比,，間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟,，實(shí)驗(yàn)周期延長。

3.夾心ELISA

先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中,，然后加入樣品,，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標(biāo)抗體,，則可稱為直接夾心ELISA,；如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合,，這種稱為間接夾心ELISA,。夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍,；同時(shí)夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合,，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測,，靈活性較高,。夾心ELISA的缺點(diǎn)是對(duì)配對(duì)抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對(duì)抗體,，則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化,，因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

4.競爭ELISA法

預(yù)先將抗原包被在固相載體上,，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體,。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入待檢抗原（或抗體）,，如果待檢物是抗原,，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體；如果待檢測物是抗體,，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原,。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體，后加底物顯色,。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比,。競爭ELISA相對(duì)以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些,，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測不純的樣品,，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。

二,、ELISA常見問題與解決方法

（1）陰性對(duì)照出現(xiàn)陽性結(jié)果

1.樣品,、試劑被污染，或加樣時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,，小心操作,。

2. 酶標(biāo)板洗滌不chedi——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔,，確保能充分洗滌,。

3.抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度,。

（2）酶標(biāo)板整體背景高

1.抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

2.底物結(jié)合濃度過高——對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋,。

3.反應(yīng)時(shí)間過長——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng),，適當(dāng)縮短顯色時(shí)間。

4.底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的,，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,，應(yīng)更換新的底物溶液。

5.底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行,。

（3）復(fù)孔之間重復(fù)性差

1.樣品數(shù)量不整齊,，加樣時(shí)間有長有短——加重復(fù)孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與第一次接近。

2.加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,，并且使用同一移液槍,。

3.洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時(shí),，操作條件,、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

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