噴霧干燥技術(shù)制備裸 siRNA 干粉吸入劑
自從 RNA 干擾（RNAi）在 20 多年前被發(fā)現(xiàn)以來，利用這種基因沉默機制來治療疾病引起了科學(xué)家的關(guān)注,。小干擾 RNA(siRNA) 是一類雙鏈 RNA 分子,，長度為 20-25 個堿基對，類似于 miRNA,，并且在 RNAi 途徑內(nèi)操作,。它干擾了表達與互補的核苷酸序列的特定基因的轉(zhuǎn)錄后降解的 mRNA，從而防止翻譯,。因此它們可以被設(shè)計成沉默任何特定蛋白質(zhì)的表達,，通過 RNA 干擾沉默基因治療各種呼吸系統(tǒng)疾病，這已在動物和臨床研究中得到了廣泛的研究,。siRNA 是一種親水性,、帶負(fù)電荷的大分子，不能穿透生物膜,，需要一個遞送載體來促進細(xì)胞攝取,，以便 siRNA 在細(xì)胞中發(fā)揮其基因沉默作用。
在許多體內(nèi)研究中,，siRNA 與遞送載體結(jié)合,，并通過靜脈給藥，遞送載體可保護 siRNA 免受核酸酶降解和血清蛋白結(jié)合,。對于呼吸系統(tǒng)的局部效應(yīng),，吸入是一種有利的給藥途徑。在酶活性低的作用位點可以實現(xiàn)高藥物濃度,，其非侵入性提高了患者的依從性并降低了總治療成本,。肺部給藥帶來的另一個吸引點是，可能不需要專門的給藥載體,，而且裸 siRNA 可獲得令人滿意的基因沉默效果，這一點已在一些研究中得到證實,。但關(guān)于 siRNA 的研究中,，使用液體氣溶膠的研究相對較多，干粉可吸入制劑研究較為有限,，本篇文獻中科學(xué)家重點研究了將裸 siRNA 以及和不同分散載體如甘露醇和L-亮氨酸通過噴霧干燥進行制劑來考察 siRNA 制備干粉可吸入制劑的可能性,。
實驗材料和方法
表1 顯示采用超純水溶解制備甘露醇、L-亮氨酸,、 HSDNA 和 siRNA 水溶液,，所有溶液的總?cè)苜|(zhì)濃度均為 1.5% w/v,。
儀器參數(shù)：
BUCHI Mini Spray Dryer B-290 & B-296 形成閉環(huán)模式
加熱溫度80℃，吸氣率為90%（干燥氣流約35m3/h）,，進料速率 1.4ml/min,霧化氣體流量 742L/h,。雙流體噴嘴，噴冒孔徑 1.5mm,。料液進行霧化干燥,，得到的干燥粉末通過旋風(fēng)分離器收集到玻璃小瓶中，粉末樣品收集后室溫下保存在帶硅膠的干燥器中,。將各粉體通過凝膠阻滯試驗,、粒度檢測、SEM,、XPS,、PXRD 和 HPLC 等方式進行物理化學(xué)表征。
▲ BUCHI 噴霧干燥儀 B-290 & 296
結(jié)果
表2 通過激光衍射測量粉末的粒度,，2% siRNA 的體積直徑較大,，范圍為 2.6-8.0um，可見隨著配方中 L-亮氨酸含量的增加,，粉末的粒徑減小,。
▲ BUCHI Mini Spray Dry B-290 & 296
圖1 采用凝膠阻滯試驗檢測噴霧干燥后 siRNA 的結(jié)構(gòu)完整性。所有三種粉體中的 siRNA 均保持完整,，噴霧干燥后未觀察到降解,。圖2 采用 HPLC 色譜檢測結(jié)果與凝膠阻滯測定結(jié)果一致，從噴霧干燥后造粒粉體中獲得的 siRNA 光譜和噴霧干燥前的相應(yīng)料液中獲得的光譜幾乎相同（峰重疊）,。圖3 通過 SEM 觀察粉體形態(tài),，無亮氨酸粉末顯示相對光滑的表面球形，隨著亮氨酸的增加,，顆粒表面變粗糙,，球形變差。當(dāng)含有甘露醇和L-亮氨酸等質(zhì)量制劑時,，顆粒坍縮,，失去球形。
結(jié)論
在這項研究中,，香港大學(xué)和悉尼大學(xué)的科學(xué)家使用噴霧干燥技術(shù)將 siRNA 的裸形式配制成可吸入的干粉,。研究了 siRNA 與甘露醇和 L-亮氨酸共混合后進行噴霧干燥造粒，過去沒有 siRNA 載量 ＞2% w/w 的吸入型 siRNA 粉劑（含遞送載體）的報道,。同時 siRNA 經(jīng)噴霧干燥后,，即使沒有通常用于絡(luò)合或封裝保護的 siRNA 的遞送載體，也能成功保持其完整性,；siRNA 粉末呈結(jié)晶狀,，殘余水分低,，這是穩(wěn)定配方的關(guān)鍵特征，但含水量都在 5%以下,，說明噴霧干燥具有良好的工藝可行性,。最后摻入 L-亮氨酸富集在顆粒表面，顯著促進了粉末的分散性,，改善了 siRNA 粉末的霧化效果,。并通過X射線光電子能譜檢測，結(jié)果表明,，L-亮氨酸在顆粒表面富集,，作為分散增強劑，能夠有效促進粉末的分散,。再檢測的不同 siRNA 配方中,，含 50% w/w L-亮氨酸的 siRNA 表現(xiàn)出最佳的空氣動力學(xué)性能，其高發(fā)射分?jǐn)?shù)（EF）約為 80%,，適度的細(xì)顆粒分?jǐn)?shù)（FPF）約為 45%,，對于干粉吸入劑具有很好實際參考意義。更重要的是,，通過凝膠阻滯試驗和 HPLC 評估,，成功地保留了 siRNA 的完整性，確保了藥物的活性,！
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文獻來源
Inhaled powder formulation of naked siRNA using spray drying technology with L-leucine as dispersion enhancer
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